26 份棉花耐盐相关种质资源遗传多样性SRAP 分析

刘雅辉， 王秀萍， 鲁雪林， 张国新， 李九欢， 李 强

(河北省农林科学院滨海农业研究所，河北 曹妃甸063200)

土壤盐渍化是影响农业生产的主要胁迫因子。中国的盐渍土近1×108hm2，且盐渍化和次生盐渍化不断扩大，盐渍化土壤结构极差，作物难以正常生长，严重影响了作物的产量和品质。因此合理开发利用盐碱地是一项迫在眉睫的任务。棉花是中国重要的经济作物，在国民经济中占有举足轻重的地位［1-2］。在粮棉争地矛盾日益突显的情况下，棉花以其较好的耐盐性，逐渐成为盐碱地一种新的优势作物。目前，中国是世界上盐碱地植棉规模最大的国家。据不完全统计［3］，中国植棉区内盐碱地约有1.7×108hm2，其中2.7×106hm2先后开发植棉。因此，选育耐盐棉花品种是目前解决盐碱地利用的一种有效手段。但是由于棉花的耐盐性十分复杂［4］，耐盐机理尚不是很清楚，这给棉花耐盐育种带来很大困难，目前尚缺乏可以在盐碱地大面积推广应用的耐盐品种。因此开展棉花品种的耐盐鉴定并对耐盐种质资源进行遗传多样性分析，拓宽遗传基础，筛选耐盐新基因，对于开发利用盐渍化土壤，扩大棉花种植面积，提高单位产量，具有十分重要的理论价值和实际意义。

SRAP 标记是由美国加州大学蔬菜作物系Li 等［5］提出的，又称为基于序列扩增多态性，是一种新型的基于PCR 的标记系统，通过独特的引物设计对开放阅读框进行扩增，因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有操作简便、结果稳定、在基因组中分布均匀、便于克隆测序目标片段、成本低廉等特点，目前已广泛应用于各种作物的品种鉴定、遗传图谱构建和遗传多样性分析等方面的研究［6-9］。在棉花上，也有大量学者利用该技术进行了遗传多样性检测、抗病基因的筛选等方面的研究［10-14］，但将该技术应用于棉花耐盐性研究还未见报道。

本研究以多年收集、鉴定的黄河流域棉区具有代表性的26 份棉花耐盐相关种质资源为试验材料，利用SRAP 技术进行遗传多样性分析，了解该区域棉花耐盐品种(品系)间遗传差异，为有针对性的选用不同类型的耐盐亲本、聚合不同耐盐基因和进一步提高耐盐种质资源的耐盐性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自河北省农林科学院滨海农业研究所耐盐旱作研究室多年收集、鉴定和筛选的26 份棉花耐盐相关种质资源，具体来源见表1。SRAP 引物参照Li 等［5］公布的通用引物，共组成88 对引物，引物序列由北京华大基因研究中心合成。

1.2 方法

1.2.1 耐盐鉴定方法 按照河北省地方标准《棉花耐盐性鉴定评价技术规范》［15］中的苗期耐盐鉴定方法，于河北省农林科学院滨海农业研究所滨海现代农业科技成果转化基地进行耐盐性试验。试验设2 个处理，耐盐性处理:在池子内填加混合均匀的土壤全盐含量为0.4%的盐碱原土，处理期间根据日蒸发量的大小，喷施一定量淡水，使盐碱土含盐量尽量保持恒定。对照:池子内填加土壤全盐含量为≤0.1%的土壤，试验期间管理同耐盐性处理。3 次重复。观察记载植株的叶片形状、颜色和受害症状，进行苗情分类，然后计算盐害指数，盐害指数分级标准:盐害指数≤15.0%为1 级，极强耐盐;15.1% ～30.0%为2 级，强耐盐;30.1% ～60.0%为3 级，耐盐;60.1% ～85.0% 为4 级，弱耐盐;85.1% ～100.0%为5 级，极弱耐盐。

1.2.2 基因组DNA 提取与检测 利用北京康为世纪生物科技有限公司生产的CottonGenDNAkit 对供试材料进行DNA 的提取，然后用北京普析通用仪器有限责任公司生产的TU-1810 紫外分光光度计检测DNA 纯度与浓度。

1.2.3 PCR 扩增和产物检测 PCR 反应体系为20.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，5 U/μlTaq酶0.2 μl，30 ng/μl 模板DNA 1.0 μl，50 ng/μl 正反引物各0.7 μl，PCR 染料2.0 μl，ddH2O 13.0 μl。PCR 反应在Eppendorf mastercycler gradient 基因扩增仪中进行。PCR 扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72℃延伸10 min，共5 个循环，然后将退火变为50 ℃，在进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，观察统计带型。

1.2.4 数据处理 观察PCR 扩增产物凝胶电泳结果，统计清晰稳定且易于辨认的条带。在同一基因位点上，每个样品扩增条带按有无记录，扩增条带存在时记为1，不存在时记为0。利用软件NTSYS-pc2.1 计算各材料间Jaccard 遗传相似性系数，并用类平均法(UPGMA)对所有材料进行聚类。

2 结果

2.1 供试材料的耐盐鉴定

26 份材料的耐盐鉴定结果(表1)显示，有3 份材料表现为强耐盐，4 份材料耐盐性弱，其余都为耐盐材料。可见大部分材料都是耐盐材料，强耐盐或耐盐性弱材料各占10%左右。

2.2 SRAP 多态性引物的筛选

首先选用耐盐差异大的2 个材料NY1 和新研96-48，对88 对引物进行筛选，40 对引物有扩增条带，且有多态性，然后用40 对引物对所有材料进行扩增，最终有29 对引物的扩增产物多态性高，带型清晰。

2.3 SRAP 多态性分析

用29 对引物组合在26 份材料中共扩增出780 个位点，多态性位点238 个，多态率达30.51%，每个引物组合的多态性位点为2 ～13 个，平均每个引物组合产生8.2 个多态性位点。其中，22 个强耐盐和耐盐材料在29 对引物中均具有多态性，多态性位点达128 个，4 个耐盐性弱的材料在15 对引物中具有多态性，多态性位点为25 个。

2.4 遗传相似性分析

利用软件NTSYS-pc2.1 计算各材料间Jaccard 遗传相似性系数，结果显示，26 个材料间的相似系数为 0.565 ～0.973，平均值0.767，分布在0.7 ～0.8 区间的占84.10%，其中自主选育的NY1 与辽棉16 的相似系数最小，为0.565，说明它们间的亲缘关系较远，遗传差异大;中棉所35 与中棉所49 的相似系数最大，为0.973，其次是邯棉103 与邯棉5158，为0.957，说明它们之间的亲缘关系较近。

22 个强耐盐和耐盐材料之间的遗传相似系数为0.565 ～0.973，平均值为0.782，4 个耐盐性弱的材料的遗传相似系数为0.733 ～0.859，均值为0.807。耐盐(强耐盐和耐盐)和耐盐性弱的材料间的遗传相似系数大多数为0.7 ～0.8。可见，本研究大部分材料的遗传相似系数较高。

表1 26 份材料名称、来源及耐盐性鉴定结果Table 1 Names，origins and salinity tolerances of 26 cotton materials

2.5 聚类分析

利用软件NTSYS-pc2.1 用类平均法(UPGMA)对所有材料进行聚类分析，在阈值为0.72 时，26 份材料被分成3 个类群，其中第一类群只包括1 份材料(辽棉16)，第二类群包括2 份材料(枝棉3 号和NY1)，其余23 份材料聚到第三类群。第三类群又可以分为2 个亚类，第一亚类包含21 份材料，第二亚类只包含2 份材料(衡棉4 和冀丰106)。

从聚类图还可以看出，一些耐盐性相同的材料分布较集中，如阈值为0.8 时，第三类群的第一亚类中除了新研96-48，大多数材料均为耐盐材料;而第二亚类中，除了鲁棉17和豫棉21，均为耐盐性弱材料。绝大部分有亲缘关系的材料聚为一类，说明该分析结果和系谱分析基本吻合。

3 讨论

SRAP 分子标记技术是在总结已有标记技术的优缺点之后开发的新型标记技术，具有引物设计简单，稳定性强等优点;它不需要进行SSR 那样复杂的引物开发，降低了RFLP 标记对DNA 浓度和纯度的高要求，取消了AFLP 的预扩增和连接步骤，比RAPD 更加高效，这些优点已在各种作物的广泛应用中得到证实。本研究结果也证明，SRAP 技术具有简单、稳定性高、重复性好的特点，而且条带清晰，扩增效果良好，多态性较高，能够较好地反映棉花耐盐相关种质资源的遗传多样性，是研究遗传变异的一种有效手段。

本研究利用SRAP 技术从分子水平上对中国黄河流域中早熟棉区部分陆地棉耐盐相关种质资源进行遗传多样性分析，结果表明多数材料的遗传相似系数都在0.7 以上，可见本研究所选的材料间遗传相似性较高，说明中国黄河流域中早熟棉区陆地棉耐盐种质资源遗传基础狭窄，这与前人［16-18］的研究结果具有一致性。陆地棉以外的其他栽培种、远缘野生种及棉属的一些野生种等材料，具有丰富的遗传多样性和突出的抗逆性，可能含有许多耐盐基因［19］，因此我们要注重这些资源的搜集、引进，并合理利用这部分资源，拓宽中国棉花耐盐种质的遗传基础。从聚类图上看，分布在不同类群的材料，由于遗传相似系数小，遗传差异较大，相互杂交更易发挥超亲优势。因此在棉花耐盐育种中尽量选择遗传相似系数小，耐盐差异大的材料配置杂交组合。

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