WY14643 对附植前小鼠胚胎体外发育及活性氧的影响

胡德宝， 庄利利， 张日欣， 张 也， 李钟淑， 方南洙

(延边大学农学院，动物遗传育种与繁殖实验室，吉林 延吉133002)

随着体细胞克隆以及转基因技术等生物工程的不断发展，对体外发育的卵母细胞以及早期胚胎的需求逐渐增多。早期胚胎的体外培养，一直是细胞工程研究中的一个重点项目，对于它的研究有利于更加直观地了解细胞，并且能提供优良的试验材料。目前学术界正面临克隆胚胎效率低的难题，一个重要原因就是体外培养体系的不完善引起氧化应激现象发生，导致胚胎发育阻滞，所以建立一套完善的早期胚胎体外培养体系是非常必要的。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是细胞内部由于新陈代谢作用发生氧化还原反应生成很多自由基，生成的自由基包括超氧阴离子自由基(O2·-)、羟自由基(HOˉ)、一氧化氮(NOˉ)、过氧化氢(H2O2)等，在各种哺乳动物的卵母细胞和早期胚胎发育的过程中，各种代谢和培养环境中都有可能产生过量ROS［1］导致氧化应激现象发生，引起细胞DNA、脂质及蛋白质的损伤［2］，甚者产生细胞碎片［3］，严重阻碍早期胚胎的体外发育。

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)是核受体家族中的配体激活受体，与过氧化物酶体的增值等功能有着紧密的联系，它包括α、β 和γ 3 种形式亚型，PPARs 在大多数细胞中都有所表达，尤其是在肾脏和心肌细胞中表达，同时具有非常重要的生物学作用，不同的亚基其生物学功能不同［4］。WY14643 是人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)特异性受体激活剂，国内外研究表明WY14643 在体内能够起到降低血糖浓度、抗细胞衰老和抵抗氧化等作用［5-6］。WY14643 激活PPARα 后，PPARα 通过和视黄素X 受体结合形成异二聚体物质，这个异二聚体物和位于抗氧化靶基因特异性启动子区域的DNA 序列相结合，通过构象变化调控抗氧化酶的活性［7］。Okaya 等［8］在肺损伤模型中的研究发现，WY14643 能够有效克服氧化应激反应，降低氧化损伤。另有研究报道，PPARα 特异性的激动剂还能够刺激内皮上的细胞产生许多自由基，通过活性氧第二信使的作用刺激各种抗氧化物酶的活性升高［9］。

综上所述，小鼠早期胚胎在体外发育过程中会受到内外各种活性氧的损伤并且容易引起发育阻滞现象。在肝脏中的研究结果表明，WY14643具有有效的抗炎抗氧化的作用，但它对附植前胚胎的作用研究甚少，本试验拟对此进行研究，旨在为更好地研究哺乳动物抗氧化机理和体外培养体系提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

昆明白系小鼠，8 ～10 周龄，购自延边大学实验动物中心。

1.2 试验试剂及仪器

孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波激素有限公司;其他相关药品非特殊说明均购自Sigma 公司;倒置显微镜(Nikon TMS);二氧化碳培养箱(TC2323);荧光显微镜NU-425-600E。

1.3 试验方法

1.3.1 胚胎的收集、处理和培养 挑选健康的雌性小鼠，每只供试小鼠于第1 d 18 ∶00 时腹腔注射10 IU 的PMSG，时隔48 h 腹腔内注射10 IU 的hCG，然后与公鼠合笼，公母数量比为1 ∶1，合笼12 h 后检查小鼠阴道栓。对于脱颈处死注射hCG 24 h 后的见栓小鼠，打开腹腔取出输卵管放置M2 中，在显微镜下挑破输卵管壶腹部，用透明质酸酶(300 mg/L)脱去合子周围的卵丘细胞，2 min 后用M2 清洗2 ～3遍，然后将收集好的无卵丘细胞的合子期胚胎分别放入之前做好的不同药物浓度的50 μl 的小滴中(每小滴10 枚)清洗2 遍，再转移到相应培养液中，在饱和湿度、5% CO2气相条件、37 ℃的培养箱中培养一定时间，之后换成M16 培养液孵育。每24 h 换液，每12 h 观察胚胎发育情况。

1.3.2 胚胎内部ROS 含量检测 取20 枚胚胎，置于1 mg/ml PVA 小滴中洗涤2 遍，然后避光置于10 μmol/L 2'7'二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)染色液微滴中，放入培养箱孵育15 min。将孵育后的胚胎冲洗干净，在荧光显微镜下荧光显色。用Imageproplus 6.0 对荧光图片量化分析，结果用平均相对荧光强度相对值表示。

1.4 试验设计

分以下步骤:(1)合子期胚胎于0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L H2O2中孵育30 min，筛选引起氧化应激的最低致死浓度。(2)合子期胚胎于0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、5.0 μmol/L WY14643 中孵育2 h，观察胚胎发育情况，确定WY14643 促进胚胎发育最适浓度。(3)最低致死浓度H2O2与最适浓度WY14643 联合处理，观察与对照组(M16 培养液)、最低致死浓度的H2O2组(A 组)、最适浓度WY14643 组(B 组)以及联合处理组(C 组)之间发育率的差异情况。(4)DCHFDA 荧光检测上一步骤中对照组、A 组、B 组、C 组中H2O2水平，观察WY14643 对H2O2的影响和各时期的变化情况。

1.5 统计分析

2-细胞早期胚胎发育率、4-细胞期胚胎发育率及囊胚率分别为2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎和囊胚与合子数的百分比。应用SPSS 17.0 进行数据差异显著性分析。每组试验重复数＞3 次。

2 结果

2.1 外源H2O2 对小鼠合子发育的影响

由表1 可以看出，用不同浓度的H2O2处理胚胎30 min 后，随后放入新的M16 中继续培养到72 h，胚胎发育率显著不同。50 μmol/L H2O2组胚胎无法发育到囊胚阶段;25 μmol/L 与0 μmol/L、10 μmol/L 组相比显著降低了4-细胞发育率和囊胚发育率(P＜0.05);0 μmol/L、10 μmol/L 组之间差异不显著(P＞0.05)。认为25 μmol/L H2O2为引起氧化应激导致胚胎发育受阻的最小致死浓度。

表1 外源H2O2 对小鼠合子发育的影响Table 1 Effect of exogenous H2O2 on development of mouse zygotes

2.2 WY14643 对小鼠合子发育的影响

WY14643 作为一种待研究的抗氧化药物，其不同浓度对合子发育影响见表2。可以看出，卵裂率是各组之间无显著性差异(P＞0.05);4-细胞发育率是0.1μmol/L WY14643 组显著高于0 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L 组(P＜0.05)，其余各组之间差异不显著(P＞0.05);囊胚发育率是0.1 μmol/L组显著高于0 μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L组(P＜0.05)，1.0 μmol/L 组显著高于0、5 μmol/L组(P＜0.05)。认为0.1 μmol/L WY14643 对于合子的发育效果最好。

表2 WY14643 对小鼠合子发育的影响Table 2 Effect of WY14643 on development of mousezygotes

2.3 WY14643 对H2O2 刺激后的小鼠胚胎作用

由H2O2诱导氧化应激的小鼠胚胎，再经过最适浓度的WY14643 处理2 h 后，胚胎发育结果见表3。在H2O2中添加WY14643 的B 组中卵裂率、4-细胞发育率、囊胚发育率显著高于单独使用H2O2的A组(P＜0.05)，同时B 组中各阶段发育率均高于对照组(M16 培养液)，但差异不显著(P＞0.05)。

表3 WY14643 对H2O2 刺激后的小鼠胚胎作用Table 3 Effect of WY14643 on development of mousezygotes by H2 O2 induced ROS

2.4 胚胎内部H2O2 的检测

收集各处理不同发育阶段胚胎避光DCHFDA染色，蓝色波长光(535 nm)激发，荧光图片量化分析见图1。可以看出，单独H2O2作用的A 组，其H2O2水平显著高于其他各组，而单独WY14643 作用的D 组显著降低H2O2水平(P＜0.05);联合处理的B 组也在一定程度上降低了H2O2水平，并且显著低于A 组(P＜0.05)，说明WY14643 能引起H2O2水平的下降。从图1 还可以看出，胚胎内部H2O2水平在4-细胞时期达到最高，囊胚时期低于其他各时期。

图1 不同处理组胚胎内部H2O2 的含量比较Fig.1 Comparison of H2O2 content in embryo among different treatments

3 讨论

3.1 H2O2 对附植前小鼠胚胎体外发育的影响

哺乳动物的早期胚胎几乎都存在体外发育阻滞现象，而ROS 可能是对胚胎体外发育不利的因素之一。Legge 等［10］研究结果发现高浓度ROS 能抑制正常细胞分裂，并且影响母型到合子型基因调控转换。本试验结果表明，经过一定浓度的外源性H2O2处理合子期胚胎后，胚胎的发育能力明显下降，这与Al-Gubory 等［11］研究结果相似，说明H2O2浓度过高能引起细胞胚胎发生氧化损伤，导致胚胎内部出现代谢紊乱，产生氧化应激，使早期胚胎发育阻滞。

3.2 WY14643 对附植前小鼠胚胎发育及胚胎内部ROS 水平的影响

WY14643 作为PPARα 的一种特异性激动剂，现已研究证实，PPARα 与氧化应激有着密切的关系，而且过氧化氢酶(CAT)也被证实是PPARα 的靶酶［12］，WY14643 通过对抗氧化酶的调控来降低细胞内ROS 水平减少氧化应激反应。超氧化物歧化酶(SOD)是细胞内重要的清除和减少自由基的抗氧化酶，其活性反映了机体抗氧化损伤的能力［13］。Marx 等［14］发现，在人内皮细胞炎症反应后，PPARs被激活，SOD基因的表达上调。试验结果表明，经25 μmol/L H2O2刺激氧化后，加入0.1 μmol/L WY14643，与对照组及单独加入H2O2组相比，WY14643 能显著性提高胚胎的发育率，通过DCHFDA 测定胚胎内部H2O2水平时发现，WY14643 添加组H2O2的水平显著性低于其他各组，也证实了WY14643 在胚胎发育过程中能够减少H2O2含量。可能是因为WY14643 的加入有效提高了抗氧化酶如SOD、CAT的活性，间接降低了ROS 水平，促进了胚胎的发育。试验还发现，在胚胎发育过程中，胚胎内部的H2O2含量在4-细胞早期达到最高，而囊胚时期有所降低，这和Nasr-Esfahani 等［15］发现的体外培养的小鼠胚胎在2-细胞晚期ROS 含量明显增多，并且在5 h 后达到最高水平相一致。

过氧化物酶体是细胞内重要的生物氧化场所，包含大量的抗氧化酶类，如CAT、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，因此它对胚胎的抗氧化起着至关重要的作用，而PPAR 与过氧化酶体增殖［16］及细胞中一些抗氧化基因表达有着相当密切的关系［9，17］。近年来WY14643 作为PPARα 特异性激动剂其抗氧化作用越来越受到关注。国外临床研究还发现［18］，WY14643 能够改善2 型糖尿病患者由脂代谢导致的氧化损伤。然而WY14643 在胚胎中的抗氧化信号转导途径以及各种抗氧化酶基因表达等分子机制还有待进一步研究。

0.1 μmol/L WY14643 能够显著提高体外胚胎发育率;小鼠4-细胞早期H2O2水平达到最高，囊胚时期显著性降低，而0.1 μmol/L WY14643 处理后能显著降低其活性氧水平，说明适当浓度的WY14643 能够有效清除活性氧，提高胚胎的抗氧化能力，有利于附植前胚胎的体外发育。

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