猪TTV2 ORF1 基因的原核表达及多克隆抗体的制备

张文文， 王小敏， 肖 琦， 周忠涛， 汪 伟， 温立斌， 李 彬， 郭容利，

张雪寒1，周俊明1， 倪艳秀1， 吕立新1， 俞正玉1， 茅爱华1， 胡屹屹1，刘永杰2，

何孔旺1

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014;2.南京农业大学动物医学院，江苏 南京210095)

TTV(Torque teno virus)又名输血传播病毒，最早是由日本学者Mushawar 等［1］于1997 年发现的，由于该病毒是从肝炎患者体内分离获得的，因此怀疑其与肝炎有关，从而引起了高度关注。随后各国对本国不同人群中TTV 感染情况进行了流行病学调查，发现人群中TTV DNA 阳性率一般在10%以上［2］。目前已经证实，除了人类可以感染TTV 以外，在灵长类动物(黑猩猩、类人猿和猴)、家畜(猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其他动物(鼠、树鼩和骆驼)体内均相继检测到了TTV 的存在［3］。研究结果表明TTV 已经在全世界猪群中广泛存在，并且可能与某些疾病的发生有关［4-5］，因此已在全球引起重视。

猪TTV 属细环病毒科(Anelloviridae)壬型细环病毒属(Iotatorquevirus)，是一种无囊膜的单股环状负链DNA 病毒［6］。猪TTV 有2 种基因型:TTV1和TTV2［2，7］。流行病学调查结果显示，在中国猪群中，TTV2 的阳性率明显高于TTV1［8-9］。ORF1基因可能编码病毒衣壳蛋白质(Cap)和复制相关蛋白质(Rep)。目前国内TTV 的检测主要依赖于病毒核酸的检出，主要采用PCR 的方法。因为TTV 在体外不能培养，无法获得天然病毒抗原，因而使用基因工程方法表达病毒重组蛋白质抗原是解决抗原来源的有效途径［10-11］。因此本试验利用大肠杆菌原核表达系统对猪TTV2ORF1基因的截短基因进行诱导表达，并制备多克隆抗体，为ORF1编码产物的检测以及研究其在病毒感染中的作用提供物质基础。

1 材料和方法

1.1 载体和菌株

TTV2 病毒DNA 和表达载体pcoldI 由本实验室(江苏省农业科学院兽医研究所)保存;大肠杆菌Trans5α、BL21(DE3)感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

LA-Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、IPTG、氨苄青霉素均购于TaKaRa 公司;蛋白质浓度定量测定试剂盒购于Invitrogen 公司;DAB显色液购于Southern Biotech 公司;Ni-NTA His-bind Resin 购于Novagen 公司;羊抗鼠IgG-HRP、羊抗猪IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 购于武汉博士德生物工程有限公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma 公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 试验动物

新西兰大白兔(4 只)购于扬州大学。

1.4 引物设计与目的基因的扩增

采用Oligo V6.0 基因分析软件，根据GenBank 上已发表的TTV2 基因序列，在ORF1基因上保守的区域设计1 对上下游引物，并在上下游引物的5'端和3'端分别加上XhoⅠ和Hind Ⅲ限制性酶切位点，目的基因长度为1 227 bp，命名为g1。引物SFg1:5'-CCGCTCGAGGACCTCTCAGAACCATGGGTAGAAG-3'(XhoI);SRg1:5'-CCCAAGCTTTGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA-3' (Hind Ⅲ)。

以TTV2 病毒DNA 为模板，PCR 扩增目的基因。反应条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min，38 个循环;72 ℃再延伸10 min。PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.5 重组表达质粒的构建

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后和表达载体pcoldI 分别用XhoⅠ、Hind Ⅲ进行双酶切，回收目的基因片段和载体片段，将其用T4 DNA 连接酶于4 ℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌Trans5α 感受态细胞，挑取菌落，重组质粒进行酶切鉴定和测序验证。

1.6 目的基因的诱导表达及可溶性分析

将鉴定正确的重组表达质粒pcold-g1转化大肠杆菌BL21(DE3)，用氨苄(100 μg/ml)抗性的LB液体培养基培养过夜，次日按2%的比例接种于新鲜LB 培养基中，培养至OD600值为0.4 ～0.6 时，加入IPTG 至终浓度为0.1 mmol/L，于15 ℃摇床培养24 h。同时设置空载体诱导对照。离心收集菌体沉淀，经超声波破碎，离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE。

1.7 重组蛋白质的纯化及Western blot 分析

按照上述诱导条件诱导重组菌液，菌体经超声波破碎后，经镍柱纯化，使用Qubit fluorometer 及其相关试剂测定纯化的蛋白质浓度。

纯化的蛋白质经SDS-PAGE 电泳后，将其转印至NC 膜上，以2%的脱脂奶粉室温封闭1 h 后，置于4 ℃过夜;经TBST 洗膜后，分别加入适当稀释的猪TTV2 阳性血清和 1 ∶3 000 稀释的鼠源His 抗体，室温孵育2 h;洗膜后再分别加入1 ∶3 000 稀释的HRP-羊抗猪IgG 和HRP-羊抗鼠IgG，室温孵育1 h;再次洗膜后进行DAB 显色。

1.8 多克隆抗体的制备

1.8.1 免疫动物 首先对新西兰大白兔耳缘动脉采血2 ml，作为阴性对照。将纯化的蛋白质按照200 μg/ml 与弗氏完全佐剂 1 ∶1 混匀，每只兔子免疫1 ml，于背部皮下多点注射，间隔7 d 后再免疫1 次。免疫后第21 d 和第28 d 将纯化的蛋白质按照200 μg/ml 与弗氏不完全佐剂1 ∶1 混匀，每只兔子免疫2 ml，7 d 后心脏采血，分离血清。

1.8.2 血清抗体效价的测定及Western blot 检测采用间接ELISA 法测定抗体的效价，具体方法如下:用碳酸盐缓冲液将纯化的重组蛋白质稀释为5 μg/ml，包被酶标板，用1%BSA 于37 ℃封闭2 h;然后将兔抗血清按 1 ∶200 ～1 ∶25 600 倍比稀释后加入酶标板，阴性对照为1 ∶50 倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液，37 ℃孵育1 h;加入1 ∶3 000 稀释的羊抗兔酶标二抗，37 ℃孵育1 h;加入TMB 显色;最后加入H2SO4终止液。以酶标仪测定450 nm 处吸光度值。计算阳性血清与阴性血清之比(P/N)，当P/N≥2.1 时为阳性，2.1＞P/N≥1.5 时为可疑，P/N＜1.5 时为阴性。

Western blot 检测:将纯化的蛋白质经SDSPAGE 后，转印至NC 膜上;一抗用 1 ∶100 稀释的兔抗血清，二抗用HRP-羊抗兔IgG，进行Western blot 鉴定。

2 结果

2.1 猪TTV2 ORF1 截短基因的扩增

以引物SFg1 和SRg1 扩增TTV2 阳性DNA，将PCR 扩增产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到1 227 bp 的目的基因(图1)，与预期结果一致。

图1 目的基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification of target gene

2.2 重组表达质粒的酶切鉴定

重组表达质粒pcold-g1经双酶切后，可见1 221 bp 的目的基因(图2)，并且测序结果与目的序列一致，表明重组表达质粒构建成功。

图2 重组表达质粒pcold-g1 双酶切鉴定结果Fig.2 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pcold-g1

2.3 重组蛋白质的诱导表达及可溶性分析

将重组表达质粒pcold-g1和空载体pcoldI 转化大肠杆菌BL21，进行诱导后，经SDS-PAGE 分析，在相对分子量5.2×104处有1 条很明显的条带，与预期目的条带大小一致，而空载体则无此条带(图3)。菌体经超声破碎后，沉淀中有明显的特异条带，而上清中没有(图4)，表明重组蛋白质以包涵体形式表达为主。

图3 重组表达质粒pcold-g1 表达产物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed product of recombinant plasmid pcold-g1

图4 pcold-g1 表达蛋白质的可溶性分析Fig.4 Solubility identification of expressed protein of pcold-g1

图5 pcold-g1 表达蛋白质的纯化和Western blot 检测Fig.5 The purification and Western blot analysis of expressed protein of pcold-g1

Western blot 结果显示在相应位置出现1 条清晰的目的条带(图7)，表明获得的多克隆抗体能

2.4 重组蛋白质的纯化及Western blot 分析

经镍柱纯化后的重组蛋白质经SDS-PAGE 分析，可见相对分子质量为5.2×104的单一蛋白质条带，纯度可达95%以上(图5)。经蛋白质定量试剂盒测定其蛋白质浓度为264 μg/ml。

以鼠源His 抗体作为一抗，以HRP-羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western blot，结果显示在相应位置上出现一条清晰的目的条带，而空载体对照未见相应的目的条带(图5)。再以猪TTV2 阳性血清作为一抗，以HRP-羊抗猪IgG 作为二抗，进行Western blot，结果显示在相应位置上出现一条清晰的目的条带(图6)。表明重组蛋白质pcold-g1 可被TTV2 阳性血清识别。

2.5 多克隆抗体效价的测定及Western blot 检测

以纯化后的表达产物融合蛋白质作为抗原包被，以HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体作为二抗，使用免疫后的兔血清抗体做梯度稀释，以免疫前兔血清作为阴性对照，以空载体表达产物包被作为空白对照，经间接ELISA 法测定兔血清的效价，结果显示阴性对照和空载体表达产物包被的一直无明显变化，而当多克隆抗体稀释倍数为12 800 时，纯化好的融合蛋白质与阴性对照OD值之比(P/N)仍≥2.1。因此，融合蛋白质对兔抗多克隆抗体具有良好的免疫原性，抗体效价为1 ∶12 800。够特异性识别相应的目的蛋白质，具有较高的特异性。

图6 一抗为猪TTV2 阳性血清的Western blot 检测Fig.6 Western blot analysis of the recombinant protein using the porcine TTV2 positive serum as the primary antibody

图7 pcold-g1 重组蛋白质多克隆抗体的Western blot 检测Fig.7 Western blot analysis of polyclonal antibody of recombinant protein of pcold-g1

3 讨论

TTV 主要由编码区和非编码区两部分组成，编码区ORF1可能编码病毒的衣壳蛋白质，ORF2 可能编码病毒的非结构蛋白质［2］。目前，TTV 检测方法主要是PCR，ELISA 方法尚未建立，是研究者急需解决的问题。国内尚未见猪TTV2ORF1基因克隆表达、功能研究的相关报道。因ORF1N 端为精氨酸富集区，含有大量的稀有密码子，不易表达。因此本试验利用PCR 技术对猪TTV2 的ORF1部分基因进行扩增，利用pcoldI 作为表达载体，大肠杆菌原核表达系统成功表达了TTV2 的ORF1截短基因。

本试验选用的表达载体pcold 是一种低温表达载体，使目的基因能在低温(15 ℃)条件下诱导表达，可以提高表达产物的溶解性和稳定性［12］。但在本试验中所表达的蛋白质仍是以包涵体的形式存在的，即使再降低温度也仍存在于包涵体中，这可能与所表达的目的蛋白质基因本身有关。此外，通过该载体上的His 标签，可以用镍柱对表达的蛋白质进行纯化。

本试验扩增的ORF1基因片段，在大肠杆菌中得到了高效表达，蛋白质以包涵体的形式存在，通过镍柱对蛋白质进行纯化，得到了高纯度的重组蛋白质。我们将猪TTV2 的阳性血清作为Western blot 的一抗，以HRP-羊抗猪IgG 作为二抗进行检测，结果显示猪TTV2 阳性血清在相应位置出现了目的条带。同时还用鼠源His 抗体作为一抗和HRP-羊抗鼠IgG 作为二抗进行Western blot 检测，也在相应位置出现了特异性反应条带，这些试验结果表明重组蛋白质得到了正确的表达，能够与TTV2 阳性血清反应，具有很好的免疫原性，为下一步建立猪TTV2 的间接ELISA 检测方法奠定了基础。

多克隆抗体在免疫学领域有着广泛的应用，在临床应用中，既能用于疾病的诊断，又能用于疾病的治疗，它在特异性、稳定性方面虽不如单克隆抗体，但是成本低廉、制备简单，具备多个抗原决定簇，能够更好地与抗原结合。本试验利用纯化的重组蛋白质免疫家兔制备的多克隆抗体经间接ELISA 检测效价为1 ∶12 800，特异性好，为ORF1基因的深入研究、检测方法的建立以及相关基因工程疫苗的研制奠定了基础。

［1］ NISHAWAR I K，ERKER J C，MUERHOF A S，et al.Molecular and biophysical characterization of TT virus:evidence for a new virus family infecting humans［J］.Roch Natl Acad Sci USA，1999，96(6):3177-3182.

［2］ NIEL C，DINIZ-MENDER L，DEVALLE S.Rolling-circle amplification of Torque teno virus(TTV)complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup［J］.J Gen Virol，2005，86:1343-1347.

［3］ OKAMOTO H，TAKAHASHI M，NISHIZAWA T，et al.Genomic characterization of TT viruses (TTVs)in pigs，cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias［J］.J Gen Virol，2002，83(Pt6):1291-1297.

［4］ DESAI M，PAL R，BANKER D D，et al.Molecular epidemiology and clinical implications of TT virus (TTV)infection in Indian subjects［J］.J Clin Gastroenterol，2005，39:422-429.

［5］ KEKARAINEN T，SIBILA M，SEGALES J，et al.Prevalence of swine torque teno virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs in Spain［J］.J Gen Virol，2006，87:833-837.

［6］ NISHIZAWA T，OKAMOTO H，KONISHI K，et al.A novel DNA virus(TTV)associared with e］evated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology ［J］.Bioehem Biophys Res Commun，1997，241(l):92-97.

［7］ OKAMOTO H，NISHIZAWA T，KATO N，et al.Moleculai cloning and characterization of a noval DNA virus(TTV)assoeiated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology［J］.Hepatol Res，1998，10(1):l-16.

［8］ 王礞礞，周艳君，陈宗艳，等.我国猪群中TTV 的鉴定及其分子流行病学分析［J］.中国预防兽医学报，2009，31(10):751-755.

［9］ 温立斌，何孔旺，杨汉春，等.中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染［J］.江苏农业学报，2010，26(1):85-90.

［10］ 刘利民，邢培清，李建斌，等.TTV 蛋白抗原在大肠杆菌中的表达［J］.河南医科大学报，2001，36(6):703-704.

［11］ 白慕群，周 旭，安 静，等.输血传播病毒ORF2 基因的克隆和原核表达［J］.中国生物制品学杂志，2007，20(3):181-186.

［12］ 戎晶晶，刁振宇，周国华.大肠杆菌表达系统的研究进展［J］.药物生物技术，2005，12(6):416-420.