DPPH 法评价大黄提取物的抗氧化活性

闫海燕

(宝鸡文理学院 陕西省植物化学重点实验室，陕西 宝鸡 721013)

研究表明，自由基与人体许多疾病的发生都有着密切的关系。在正常的生理状态下，体内自由基会不断产生，并不断地被清除，使之维持在一个正常的生理水平上，过多或过少都会给人体造成损伤。因此，研究自由基的检测方法具有十分重要的意义。大黄是我国传统中药材之一，具有多种药用功效，随着大黄研究的不断深入，从中挖掘抗氧化药物很有希望［1］。

本实验采用DPPH 自由基清除法对大黄进行了抗氧化能力的测定，为进一步研究其抗氧化活性及开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大黄，宝鸡方晟药业公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma 公司;甲醇，色谱纯。

CP225D 电子天平;XS2 酶标仪;R-1002 型旋转蒸发仪;KQ5200E 型数控超声波清洗器。

1.2 大黄抗氧化成分的提取［2］

准确称取0.5 g 大黄药材，加入50 mL 溶剂，超声提取，减压回收得大黄粗提物。用甲醇溶解，定容于10 mL 容量瓶中，备用。

1.3 抗氧化性能测试

1.3.1 DPPH 溶液的配制及标准曲线的绘制精密称取DPPH 0.021 2 g，加甲醇溶解，定容至50 mL量瓶中，得0.424 mg/mL 的储备液。分别精密移取1，2，4，6，8 mL 于5 个10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇为参比，在517 nm 波长处测定各溶液的吸光度。根据吸光度和质量浓度绘制标准曲线，得线性回归方程为Y = 0. 998 1X +0.031 8 (r=0.999 1)，DPPH 在质量浓度为0.042 4～0.339 2 mg/mL 范围内线性关系良好。

1.3.2 自由基清除率的测定称取DPPH 标准品8 mg，甲醇溶解定容至100 mL，得质量浓度为0.08 mg/mL的DPPH 溶液。在96 孔板中，每孔分别加入100 μL 不同浓度的样品溶液和等体积的DPPH 溶液，室温避光静置30 min，于517 nm 波长处测定吸光度Ai;同时测100 μL 甲醇与100 μL DPPH 混合后吸光度Ao;100 μL 样品液加100 μL 甲醇混合后吸光度Aj。每个样品平行测定4 次，取其平均值，按下列公式计算清除率:

2 结果与讨论

2.1 大黄抗氧化成分提取条件

分别测试1.2 节中各种因素对大黄提取物清除DPPH 能力的影响，结果见图1。

图1 大黄抗氧化活性物质提取实验结果Fig.1 Results of experiments for extracting antioxidants from Rheum palmatum L.

由图1 可知:①除了用水作溶剂提取物清除率稍低外，其余几种溶剂提取物均有较强的清除能力，其中乙醇提取物抗氧化能力最强，甲醇提取物次之，由于乙醇具有价廉易得等优点，所以选用乙醇作为提取溶剂;②当乙醇浓度达70%时，大黄抗氧化能力最强;随着乙醇浓度进一步增加，抗氧化能力却出现下降趋势，这可能是由于乙醇浓度过高，一些杂质大量溶出，从而影响大黄抗氧化能力，所以选择70%乙醇进行提取;③当采用70%乙醇提取时，大黄提取物抗氧化能力在提取30 min 时最强，随着提取时间的增加反而减小，这可能是由于超声时间过长，溶液温度升高，溶液中杂质增多粘度增大，从而影响抗氧化物质的溶出［3］，故选定超声时间为30 min;④用70%乙醇提取，提取时间为30 min，大黄提取物抗氧化能力随料液比增加而增大，说明料液稀释度增加有利于抗氧化物质的溶出，但随料液比≥1∶40(g/mL)后抗氧化能力反而减弱。考虑到溶剂耗量和回收等实际问题，最终选择1∶40 g/mL的料液比。

当上述条件不变，超声次数为1，2，3 次时，所得提取物对DPPH 自由基的清除率依次为95.08%，96.89%，97.01%，考虑到资源的合理利用，所以以2 次提取较为合理。

另外，对不同提取方法进行对比，超声提取、浸提、回流提取清 除率分别为96. 89%，94. 7%，88.96%。可见超声提取物自由基清除率最高。

2.2 大黄不同极性提取物抗氧化活性研究

2.2.1 大黄不同极性提取物的制备［4］精密称取大黄药粉50 g，以2.1 节的优化提取条件进行提取，提取液减压浓缩至干，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇进行萃取，回收溶剂，得到4 个不同极性提取物。取各提取物适量置于蒸发皿中，真空干燥备用。

2.2.2 样品溶液配制分别精密称取石油醚、乙酸乙酯、氯仿及正丁醇浸膏0.002 2 g，用甲醇溶解，定容至1 mL 样品管中，作为样品溶液。

2.2.3 不同极性提取物的清除率曲线将样品溶液分别用甲醇稀释，配制成质量浓度为0.02，0.04，0.08，0.12，0.16，0.2，0.4，0.6，2 mg/mL 的样品溶液，根据1.3.2 节的测定方法，分别加入相同体积的DPPH 溶液，测定其吸光度，以各极性提取物不同质量浓度下的清除率为纵坐标，各极性提取物质量浓度为横坐标作图，得到不同极性提取物的清除率曲线，结果见图2。

图2 大黄不同极性部位的清除率曲线Fig.2 The clearing rate curves of different polar fractions from Rheum palmatum L.

由图2 可知，各提取物均有较强的清除DPPH自由基作用，其中石油醚、乙酸乙酯提取物的清除DPPH 自由基能力最强，正丁醇提取物次之，氯仿提取物的作用较弱。

3 结论

以提取物清除DPPH 自由基能力为评价指标，大黄抗氧化物质的提取条件为:70%的乙醇为溶剂，料液比1∶40 g/mL，超声提取2 次，每次提取30 min;大黄不同极性提取物进行抗氧化活性测试。结果表明:各提取物均有较好的清除DPPH 自由基作用，这可能是由于经过不同极性试剂提取后，具有抗氧化能力的活性物质浓度、纯度较高，从而表现出较好的抗氧化活性。其中石油醚提取物和乙酸乙酯提取物在DPPH 自由基清除体系中活性最强。当质量浓度增大到2.0 mg/mL 时，石油醚提取物清除率可达到92.7%，说明大黄是一种优良的抗氧化剂。

［1］ 王春霖. 大黄的研究进展［J］. 甘肃科技，2013，29(14):147-149.

［2］ 吕慧英，赵晨曦，吴海，等. 大黄提取物抗氧化活性与游离蒽醌相关性的研究［J］. 中草药，2010，41(3):412-415.

［3］ 苑子夜，苏印泉，张强，等.DPPH 法测定杜仲叶提取物的抗氧化活性［J］. 西北林学院学报，2011，26(6):119-123.

［4］ 董秀英，吕青涛，张国英，等.DPPH 法测定九州虫草不同极性部位抗氧化活性［J］. 中国实验方剂学杂志，2011，17(10):70-73.