我国不同地域烟曲霉临床分离株CSP基因型及对抗真菌药物的敏感性分析

唐梦丹 郑建峰 沈亮亮 姜淼 赵敬军

我国不同地域烟曲霉临床分离株CSP基因型及对抗真菌药物的敏感性分析

唐梦丹 郑建峰 沈亮亮 姜淼 赵敬军

目的探讨我国不同地域致病烟曲霉临床分离株CSP基因型分布情况,以及不同地域、不同CSP基因型烟曲霉药物敏感性有无差异。方法对福建、上海、河北及北京四地临床分离到的112株烟曲霉分别通过形态学、温度试验及β微管蛋白分子生物学测序鉴定,再对烟曲霉进行CSP基因分型,同时用M38-A方法测定伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B对不同型别烟曲霉的最低抑菌浓度(MIC)。结果112株曲霉均鉴定为经典烟曲霉,共确定11个CSP基因型,其中t04A、t03、t01最多见,分别为32株、17株、24株。福建分离株以t10、t04A、t01最常见,上海分离株以t04A、t01最常见,河北分离株以t01、t03、t04A最常见,北京分离株以t02、t04A、t01和t03最常见,t25为1个新CSP基因分型,新基因型菌株的菌落形态、生长速度、最适生长温度与其他菌株并无显著差别。不同CSP基因型烟曲霉对抗真菌药物敏感性差异无统计学意义,但福建地区分离株对伊曲康唑的MIC值低于其他三地的分离株。结论烟曲霉临床株CSP基因型存在一定的地域特点,不同基因型的烟曲霉对抗真菌药物的敏感性差异无统计学意义,而不同地域来源烟曲霉对伊曲康唑敏感性存在差异。

曲霉菌,烟;微管蛋白;基因型

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是侵袭性曲霉病最主要的致病菌。烟曲霉复合体包含25个不同种的菌,其中8个无性型,17个有性型。一些新的菌种如A.lentulus、A.udagawae、Neorsartorya fischeri、N.pseudofischeri也可以致病［1］,但其菌落形态及镜下形态都与经典烟曲霉极为相似,往往不容易区分,因此,正确的菌种鉴定依赖于温度试验及分子生物学手段。不同烟曲霉复合体分支最高生长温度不同,经典烟曲霉最高生长温度为48℃以上,而A.lentulus、A.udagawae最高生长温度分别为45℃和42℃［2］。不同分支的烟曲霉对抗真菌药物的敏感性不同,有些菌株如A.lentulus、A.udagawae已开始出现耐药［3］。CSP分型是目前可以用于经典烟曲霉的国际标准化命名体系,已经在国内外得到公认。CSP基因分型是对烟曲霉细胞表面蛋白(cell surface protein)编码基因进行扩增测序,利用其编码区域内的串联重复序列多态性进行分型［4-7］。本研究旨在对福建、上海、河北及北京四地临床分离的烟曲霉进行形态学、温度试验及分子生物学鉴定,再对烟曲霉进行CSP基因分型,同时用M38-A方法测定伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B对不同型别烟曲霉的最低抑菌浓度(MIC),以探讨不同地区烟曲霉CSP型别的分布特点、不同基因型烟曲霉与抗真菌药敏感性的关系,同时探讨不同地区烟曲霉对抗真菌药物的敏感性是否存在差异。

对象与方法

一、菌株来源

本研究收集了112株不同地域临床分离到的烟曲霉,分别来自于北京(28株)、上海(24株)、福建(34株)及河北(26株)。其中104株分离于痰液,4株分离于鼻旁窦,另外皮肤、角膜、脓性分泌物及胆汁各分离到1株。

二、方法

1.形态学鉴定:把菌株点植在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)37℃培养3～7 d,每日观察并记录菌株生长情况,包括菌落大小、颜色、形状、生长速度和质地,同时行KOH和乳酸酚棉蓝染色观察镜下孢子形态,顶囊范围、层数等。

2.温度生长试验:将鉴定出的烟曲霉菌株分别置于25℃、37℃和48℃恒温培养箱中培养3～7 d,观察菌落是否生长。

3.分子生物学试验:采用玻璃珠法提取烟曲霉基因组DNA［8］。对β微管蛋白进行PCR扩增后,取40 μl PCR产物及上游引物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行单向测序,测序结果在Genbank上用BLAST软件进行比对。

4.CSP基因分型:对鉴定出的经典烟曲霉进行CSP基因扩增测序后［4］,在其碱基序列中使用Microsoft Word的查找与替代功能寻找重复单位,明确其连接顺序,并利用mega5.0软件查找其重复区域上游第 1、14、15及下游第 1、2、3密码子突变类型,根据国际标准化分型命名进行分型［4］。

5.药物敏感性试验:参照2003年美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的产孢丝状真菌抗真菌药物敏感性试验方案M38-A进行［9］。以烟曲霉ATCC204305、近平滑念珠菌ATCC22019作为质控菌株,测定临床分离到的烟曲霉对伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B的MIC。每次试验时同时进行标准株的敏感性测定,每次结果显示其MIC总介于同一范围、且各药物每次测定的MIC波动不超过1个稀释度方认为试验操作无误。

6.统计学方法:采用SPSS 20.0统计软件包对不同CSP型别、不同地区烟曲霉的MIC进行Kruskal-Wallis秩和检验。

结 果

一、曲霉的形态学及测序鉴定结果

112株曲霉经培养及乳酸酚棉蓝染色后镜下观察,均为烟曲霉;112株烟曲霉在48℃时均能生长,支持为经典烟曲霉;通过β微管蛋白序列鉴定,均能将曲霉鉴定到种,与Genbank中经典烟曲霉序列比对,呈现98%以上一致性,证实均为经典烟曲霉。

二、烟曲霉的CSP基因分型结果

对4个地区的烟曲霉临床分离株进行CSP分型,共分为11型。其中t25基因型为新CSP分型,此烟曲霉来自福建,分离自脓液。t04A、t03和t01为最常见3种基因型,其中福建分离株以t10、t04A、t01为常见,上海分离株以t04A、t01为常见,河北分离株以t01、t03、t04A 为常见,北京分离株以 t02、t04A、t01和t03为常见,另外t02主要分离自河北、北京,而t10主要分离自福建(表1)。对新发现的t25型菌株进行研究发现,其菌落形态、生长速度、最适生长温度与其他菌株并无显著差别。

三、不同基因型及不同地区烟曲霉临床分离株药敏试验结果

112株烟曲霉分离株的MIC范围见表2,伏立康唑为0.125～1 mg/L,伊曲康唑为0.125～2 mg/L,两性霉素B为0.125～4 mg/L。7种基因型的烟曲霉对伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B的敏感性差异无统计学意义(均P＞0.05)。t06A、t17、t18B因只有2株,t25只有1株,未进行统计学比较。福建分离株对伊曲康唑的敏感性最高,与上海、河北及北京的分离株比较差异有统计学意义(P＜0.05);而4个地区菌株对伏立康唑、两性霉素B的敏感性差异无统计学意义(均P＞0.05)。

表2 3种抗真菌药对不同地域及不同基因型烟曲霉的最低抑菌浓度(MIC)范围(mg/L)

讨 论

曲霉的准确鉴定和分型是曲霉属系统发生学的基础,同时对曲霉感染的实验室诊断和流行病学调查具有重要意义。烟曲霉不同分支的菌落和镜下形态特征极为相似,仅凭形态学往往难以区分。研究显示,利用β微管蛋白基因(β-tubulin)、钙调蛋白基因、Rodlet A的序列分析可以将曲霉鉴定到种［10］。烟曲霉不同分支对抗真菌药物的敏感性不同,有临床研究发现,烟曲霉复合体的一些菌株对唑类和两性霉素B等抗真菌药物出现了耐药［11-12］。因此,在临床工作中,准确鉴定烟曲霉相关菌株,对于指导抗真菌药物的选择,改善患者预后具有重要意义。我们对北京、上海、福建及河北多家医院临床分离到的112株烟曲霉进行形态学、温度试验及β微管蛋白序列分析,证实我们收集的临床分离株均为经典烟曲霉,且未发现这些菌株常见生物学性状的差异,与李若瑜等［7］研究结果一致。

CSP基因多态性在于其编码区内重复单位不同的顺序和数目变化及重复区域两侧的点突变。虽然有相关研究表明,CSP基因分型的分辨率不如微卫星序列分型,但其有简便、快速、无需特殊软件处理等优势［5］。 最早 Klaassen 等［6］对荷兰不同医院分离到的209株烟曲霉进行CSP基因分型,发现了19个基因型。同年Kidd等［4］对澳大利亚的164株烟曲霉进行CSP分型增补至22个基因型。李若瑜等［7］对北京大学真菌病研究中心保存分离自125例患者的162株烟曲霉临床株进行CSP分型,分为16型,且发现了5个新的基因型,使CSP基因型分型增至27个。本研究中对4个地区临床分离到的112株经典烟曲霉进行CSP分型,分为11型,其中1个为新型t25。通过对发现的新基因型菌株进行生物学特性研究,发现其菌落形态、生长速度、最适生长温度与其他菌株并无显著差别。另外t02主要分离自河北、北京,而t10主要来自福建,而且从福建分离到的烟曲霉中发现有12株t10型,t10占福建总株数的35.29%,这些结果在一定程度上提示,不同地区可能存在不同的流行菌株。如果我们从更多地区分离更多烟曲霉菌株进行深入研究,将可以更好地反映我国境内烟曲霉菌株CSP分型及其分布情况。另外致病菌株与环境菌株的关系国外也有研究报道,Leenders等［13］对荷兰鹿特丹大学医院院内和周围环境中的烟曲霉分布进行了长达14个月的研究,证实血液病病房致病烟曲霉菌株与环境中持续存在达1年以上的菌株有关。后续研究我们有必要收集多家医院院内和周围环境空气中的烟曲霉进行CSP基因分型比较研究。

我们在进行烟曲霉的药物敏感性测定中,判定点采用两性霉素B MIC＞8 mg/L,唑类药物MIC＞2 mg/L即为耐药［14］。我们对不同CSP型别的烟曲霉菌株进行比较,未发现不同CSP类型烟曲霉对伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B敏感性存在统计学差异,而且新发现的t25菌株对这3种药物不存在耐药情况。同时通过对4地临床分离到的烟曲霉MIC进行比较,发现以福建地区分离株对伊曲康唑的MIC最低,可能与不同地区临床对唑类药物的使用频率、医务人员使用伊曲康唑预防用药有一定关系。

志谢北京大学第一医院皮肤科,复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,河北医科大学附属第二医院皮肤科,福建医科大学附属协和医院检验科提供研究用烟曲霉

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CSP genotypes and antifungal susceptibility ofAspergillus fumigatusisolates from clinical settings in different regions of China

Tang Mengdan*，Zheng Jianfeng，Shen Liangliang，Jiang Miao，Zhao Jingjun.*Department of Dermatology，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065，China

Zhao Jingjun，Email:zhaomyco@163.com

Objective To describe the CSP genotypic profile in clinical isolates ofAspergillus fumigatesfrom different regions of China，and to investigate if there is a difference in antifungal susceptibility amongA.fumigatesof different CSP genotypes and from different regions.Methods Totally，112A.fumigatesstrains clinically isolated from Fujian，Shanghai，Hebei and Beijing were included in this study，and identified according to macro-and micro-morphological characters，growth temperature and β-tubulin sequence.ClassicA.fumigatusstrains were typed according to CSP gene sequence.The minimal inhibitory concentrations(MICs)of voriconazole，itraconazole and amphotericin B toA.fumigateswere determined in accordance with the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)M38-A protocol.Results All the strains were identified as classicA.fumigates，and fall into 11 CSP genotypes.The most common genotypes were t04A(n=32)，t03(n=17)and t01(n=24)in all the strains，t10，t04A and t01 in Fujian，t04A and t01 in Shanghai，t01，t03 and t04A in Hebei，t02，t04A，t01and t03 in Beijing.OneA.fumigatusstrain was identified as a new CSP type t25 in Fujian，which showed no obvious difference in morphology，growth rate or appropriate growth temperature from the other CSP genotypes ofA.fumigatusstrains.No statistical difference was found in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different genotypes ofA.fumigates，whereas the MICs of itraconazole were significantly lower inA.fumigatesisolates from Fujian than in those from the other three regions.Conclusions The CSP genotypic profile ofA.fumigatesvaries in clinical isolates from different regions.No significant difference is observed in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different CSP genotypes ofA.fumigates，but the susceptibility to itraconazole is somewhat different betweenA.fumigatesstrains from different regions.

Aspergillus fumigatus；Tubulin；Genotype

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.006

国家自然科学基金(81071329)

200065上海,同济大学附属同济医院皮肤科(唐梦丹、沈亮亮、姜淼、赵敬军);福建医科大学协和临床医学院(郑建峰)

赵敬军,Email:zhaomyco@163.com

2013-08-09)

(本文编辑:颜艳)