在线固相萃取—高效液相色谱—串联质谱法同时检测大豆不同部位的4种植物激素

贾鹏禹等

摘 要 采用双三元液相色谱（Dual gradient liquid chromatography，DGLC）建立了在线固相萃取技术与电喷雾串联质谱联用方法（Online SPE DGLCESI MS/MS），并成功应用于实际样品检测。本方法同时检测大豆不同部位中的4种酸碱性植物激素（赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素（ZT）和脱落酸（ABA））。通过考察固相萃取富集柱、分析色谱柱、流动相对植物激素的保留和选择性的影响，获得较高的灵敏度、回收率、稳定性及精密度。大豆样品经液氮低温研磨，以80%甲醇溶液提取，再经离心稀释过滤后，进样分析。进样后样品经在线固相萃取Hypersep Retain AX柱洗脱保留，目标分析物依次转移至分析柱Acclaim PA2色谱柱，并以0.1%甲酸和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，采用选择反应监测离子模式（SRM）同时采集正负离子通道进行定性分析，基质标准曲线外标法进行定量分析，GA3， IAA， ZT在0.1～50 μg/L 范围内线性良好，检出限为0.0002 μg/g； ABA在0.5～50 μg/L的范围内线性良好，其检出限为0.0010 μg/g。以0.8， 4.0和40 μg/L分别为低、中、高浓度考察4种植物激素的回收率为76.1%～93.5%，RSD为0.8%～6.0%。结果表明，籽粒中含有的ABA浓度明显高于其它部位。本研究为快速准确地分离和测定大豆不同部位内源激素提供了有效方法。

4 结 论

本实验建立了双三元液相色谱串联质谱测定大豆不同部位的内源激素在线固相萃取液质联用分析方法。在满足常规分析的同时，针对本实验中遇到的基质干扰大、样品前处理复杂、重现性差、目标分析物含量低等问题通过Online SPE技术在线除杂富集解决，有较多成熟的应用[15，16]。

通过与已发表的关于植物激素研究的文献比较[11，12]，本方法的检测限有明显优势，通过选择合适的SPE柱，保证不同性质的植物激素可以同时保留，与基质分离，一次进样同时检测酸碱性植物激素，检测结果更加全面，提高了检测效率。 文献[17]采用HPLC方法分析大豆中的植物激素， GA3检出限为0.5 μg/g，样品未检出，ABA含量明显高于其它成分。本实验结果与文献[17]相符。 本方法样品前处理简单方便，灵敏度高，固相萃取在线分析技术是一种高通量，快速的植物内源激素检测技术，检出限完全能满足农业科学研究需要。被测组分提取、浓缩、分离的在线进行，不仅省时而且改善了检出限；而且具有抗化学干扰、可靠性好的优点，特别适用于复杂基质中低含量组分的检出。本方法将有望广泛地应用于农业科学领域生理生化指标中被测物的高灵敏度、高准确度检测。

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15 Liu R， Ruan T， Wang T， Song S， Guo F， Jiang G. Talanta， 2014， 120： 158-166

16 Zeng M F， Zhang J， Yang Y F， Jin Y， Xiao W， Wang Z， Ding G， Yan R. J Pharm Biomed Anal.， 2014， 88： 354-363

17 ZHANG XiuHong， WANG WenRui， XU XiaoFeng， BAO YuLong. Chinese Journal of Health Laboratory Technology.， 2012， 22（12）： 2825-2826

张秀红， 王文瑞 ， 徐晓枫， 包玉龙. 中国卫生检验杂志， 2012， 22（12）： 2825-2826

An Automated Dualgradient Liquid Chromatography

MS/MS Method for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Plants Hormones in Different Parts of

Soya Beans and Its Application to a Real Analysis

JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652

钟冬莲， 丁 明， 汤富彬， 莫润宏， 滕 莹. 分析化学， 2013， 41（11）： 1739-1743

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15 Liu R， Ruan T， Wang T， Song S， Guo F， Jiang G. Talanta， 2014， 120： 158-166

16 Zeng M F， Zhang J， Yang Y F， Jin Y， Xiao W， Wang Z， Ding G， Yan R. J Pharm Biomed Anal.， 2014， 88： 354-363

17 ZHANG XiuHong， WANG WenRui， XU XiaoFeng， BAO YuLong. Chinese Journal of Health Laboratory Technology.， 2012， 22（12）： 2825-2826

张秀红， 王文瑞 ， 徐晓枫， 包玉龙. 中国卫生检验杂志， 2012， 22（12）： 2825-2826

An Automated Dualgradient Liquid Chromatography

MS/MS Method for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Plants Hormones in Different Parts of

Soya Beans and Its Application to a Real Analysis

JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652

钟冬莲， 丁 明， 汤富彬， 莫润宏， 滕 莹. 分析化学， 2013， 41（11）： 1739-1743

11 Hou S J， Zhu J， Ding M Y， Lv G H. Talanta， 2008， 76（4）： 798-802

12 Novak O， Hauserova E， Amakorova P， Dolezal K， Strnad M. Phytochemistry， 2008， 69（11）： 2214-2224

13 Liu S， Chen W， Qu L， Gai Y， Jiang X. Anal Bioanal Chem， 2013， 405（29）： 1257-1266

14 Fan S， Wang X， Li P， Zhang Q， Zhang W. J SEP SCI， 2011， 34（6）： 640-650

15 Liu R， Ruan T， Wang T， Song S， Guo F， Jiang G. Talanta， 2014， 120： 158-166

16 Zeng M F， Zhang J， Yang Y F， Jin Y， Xiao W， Wang Z， Ding G， Yan R. J Pharm Biomed Anal.， 2014， 88： 354-363

17 ZHANG XiuHong， WANG WenRui， XU XiaoFeng， BAO YuLong. Chinese Journal of Health Laboratory Technology.， 2012， 22（12）： 2825-2826

张秀红， 王文瑞 ， 徐晓枫， 包玉龙. 中国卫生检验杂志， 2012， 22（12）： 2825-2826

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JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652