分离自传统发酵乳制品中具有优良发酵特性的保加利亚乳杆菌的筛选*

乌仁图雅，德亮亮，扎木苏，秦艳婷，陈红霞，刘文俊，张和平，孟和毕力格

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重要实验室，内蒙古呼和浩特，010018)

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是乳酸菌中最具有应用价值的菌种，尤其是在酸奶发酵中，常常作为发酵剂菌种。保加利亚乳杆菌在酸奶生产过程中的作用非常重要，是酸奶产品产黏、产香、产酸的主要菌种之一［1］。在酸奶发酵过程中通常采用德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)作为发酵剂菌种［2］。发酵剂发酵特性即产酸、产香、产黏、蛋白和脂肪分解、乳糖代谢和后酸化等直接关系到发酵乳制品的品质和特性。

保加利亚乳杆菌发酵特性主要包括:(1)产香特性。保加利亚乳杆菌在发酵过程中能够产生特殊的香气，主要是乳酸和羰基类化合物组成，例如:乙醛、丙酮、双乙酰，其中乙醛是主要的风味物质，乙醛含量的多少决定了发酵乳的风味［3-4］。保加利亚乳杆菌是酸奶生产过程中主要产乙醛的菌株，是由于保加利亚乳杆菌中的苏氨酸醛缩酶活性要比嗜热链球苏氨酸醛缩酶活性菌强［5-6］;(2)产酸特性。保加利亚乳杆菌具有非常强的产酸能力和耐酸性，是酸奶发生后酸化的主要发酵剂菌株，在贮藏期间使酸奶的pH值持续下降，以致出现消费者不可接受的高酸度及感官质量下降的现象［7-8］。

在自然状况下筛选出风味独特、后酸化能力弱、活力较高的具有优良发酵特性的保加利亚乳杆菌是制备高效发酵剂和生产优质酸奶的关键环节和首要任务。近年来，刘娜等人［9］通过保加利亚乳杆菌对牛乳的pH值、滴定酸度、黏度、游离氨基氮和脱水收缩性等指标产生的影响进行分析，筛选出了具有优良发酵特性的保加利亚乳杆菌。高姝冉［10］也有类似报道。李延华等人［11］通过对发酵乳的风味成分进行分析，筛选出了发酵特性优良的保加利亚乳杆菌。另外，徐成勇等人［12］以保加利亚乳杆菌后酸化能力弱为依据，最终筛选出优良菌株。而优质的发酵剂不仅后酸化能力弱，且需风味独特，因此，本实验结合保加利亚乳杆菌的产酸特性和产香特性为依据筛选出具有优良发酵特性的保加利亚乳杆菌，为开发直投式酸奶发酵剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

试验所用的11株发酵乳杆菌(IMAU20234，IMAU20775，IMAU20342，IMAU20360，IMAU20706，IMAU20295，IMAU20423，IMAU20136，IMAU20227，IMAU20404，ND02)从牧区传统发酵乳制品中分离得到，现保藏于作者所在实验室乳酸菌菌种资源库;Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus ND02 为该实验室以商业发酵剂公司Chr．Hansen的YC-X11中的德氏乳杆菌保加利亚亚种作为对照筛选出的具有优良发酵特性的菌株［13］，因此本研究以ND02为对照菌株。

1.2 原料与试剂

全脂奶粉(新西兰恒天然集团)，乙醛检测试剂盒 K-ACHYD(Megazyme，Ireland)，MRS(Man Rogosa Sharpe)液体、固体合成培养基(CM0785B，英国OXOID公司)，双乙酰标品、三氯乙酸 (国药集团化学试剂有限公司)等。

2 实验方法

2.1 菌株的活化培养

将11株供试菌株于MRS液体培养基活化，并连续传2代，采用MRS固体培养基倾注法，进行保加利亚乳杆菌活菌计数。

2.2 发酵乳样品的制备

全脂复原乳(全脂粉11．5%、蔗糖6．5%)预热至60℃然后高压均质，95℃杀菌10 min，急冷之后按添加量5×106CFU/g接入发酵剂，置于42℃培养发酵至pH 4．5时终止发酵，置于4℃冰箱中后熟21 d。

2.3 保加利亚乳杆菌产酸特性试验

2．3．1 菌株发酵时间的确定

发酵乳样品从发酵开始到发酵乳pH值下降至4．5所需时间为发酵时间，在发酵期间，每隔4 h测定1次发酵乳样品的pH值，当发酵乳pH值下降至4．5时终止发酵并确定其发酵时间。

2．3．2 贮藏期间发酵乳样品pH值的测定

在后熟期间，分别在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d测定发酵乳pH值。取3个平行乳样品，冷却至17～20℃，采用pH计测量pH值。

2．3．3 贮藏期间滴定酸度的测定

后熟期间分别在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d测定其滴定酸度。准确称量5．00 g发酵乳样品匀浆，至少取3个平行，置于100 mL三角瓶中，加入40 mL新煮沸冷却至40℃(去CO2)水，再加入2滴0．5%的酚酞乙醇溶液作指示剂，轻轻摇匀，用0．1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至微红色在30 s内不消失为止。公式如下:

2.4 保加利亚乳杆菌产香特性试验

一般在发酵结束后48 h之内保加利亚乳杆菌风味物质的产量达到最高值，之后随着贮藏时间的延长而下降。其中乙醛在4℃冷藏后含量有较大变化，一般在12 h和24 h达到最高［14］。因此本研究在发酵乳后熟期间，分别在 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d 和21 d测定发酵乳样品中风味物质乙醛和双乙酰的含量。

2．4．1 乙醛含量的测定

在后熟期间，分别在 0、8、12、24、36、48 h、7、14d和21 d采集样品。按照以下操作进行乙醛含量测定:分别取5．00 g乳样加0．5 mL 20%的柠檬酸、再加10 mL三蒸水、摇匀、室温放置10 min，然后在4℃，4 000 r/min离心10 min取上清，用滤菌器过滤收集于1．5 mL EP管中。采用乙醛检测试剂盒 KACHYD，具体方法参照试剂盒说明书。

2．4．2 双乙酰的检测方法

(1)发酵乳样品前处理:取发酵乳样15 mL，加15 mL16%的三氯乙酸溶液，混匀、室温静置10 min，然后在4℃，4 000 r/min离心10 min，将上清液用滤纸过滤1遍，以保证澄清。同时，用无菌的全脂乳作为对照。

(2)双乙酰的测定:用微量进样器吸取20 μL双乙酰标准品，溶于蒸馏水中并定容至500 mL。取12支编号的试管分成 2 排放置，分别加 0．0、2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL 的标准溶液各 2 管，并分别用蒸馏水补足10 mL，每管中分别加10 mL 16%的三氯乙酸，这时双乙酰标准溶液的浓度分别为 0．0、4．0、8．0、12．0、16．0 和 20．0 μg/mL。第 1 排试管中加入0．25 mL 1%的邻苯二胺溶液，第2排试管不加作为对照组;摇匀后置于黑暗处放置30 min。反应完成后加入 4．0 mol/L HCl终止反应，第 1排试管加 1．0 mL，第2排试管加1．25 mL，混匀后以第2排试管空白作为参比液，在335 nm波长下用石英比色皿测定吸光度值。以双乙酰浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取待测样品，用16%的三氯乙酸溶液稀释适当的倍数，重复上述过程，然后根据双乙酰标准曲线可获得待测样品中双乙酰质量浓度(μg/mL)。

3 实验结果

3.1 发酵时间的确定

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus菌株从发酵开始至发酵终点(发酵乳pH 4．5时)所需要的时间如表1所示。

表1 不同Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus菌株发酵乳发酵时间Table 1 Time required for yogurt fermentation with different Lb.delbrueckii ssp.bulgaricus strains

由表1可知，11株供试菌中3株(IMAU20136、IMAU20227、IMAU20404)发酵时间超过23 h，因此在后续试验中筛除。其余7株菌的发酵时间基本集中在10～15 h，并且通过比较对照菌株ND02，其发酵用时为15．67 h，比8株菌都长。因此，根据菌株发酵所需的时间初步选定 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20342、IMAU20360、IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423可能会作为优良菌株。

3.1 贮藏期间pH值变化

图1是由不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵的发酵乳在发酵终点0 h以及4℃条件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 的 pH 值变化。

图1 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵乳样品贮藏期间pH值的变化Fig．1 The pH values of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由图1可知，贮藏0～48 h期间各菌株发酵乳的pH值变化趋缓，贮藏第7天时，菌株IMAU20706、IMAU20295和IMAU20423发酵乳pH值迅速下降。其中，IMAU20295发酵乳的pH值下降得最快，贮藏21 d时pH下降至3．65;这是由于后酸化能力强的保加利亚乳杆菌，发酵乳pH值3．8时仍能够继续生长，同时分解乳糖产生乳酸，导致发酵乳pH值持续下降，严重影响发酵乳质量［15］。对照菌株ND02发酵乳的pH值下降相对慢，贮藏第21天时pH值仍为4．20。菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和IMAU20360发酵乳的pH值降的相对较慢，贮藏第21天时，发酵乳的 pH 值分别为 4．11、4．17、4．10 和4．08，表明后酸化能力较弱。

3.2 贮藏过程中滴定酸度变化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵的发酵乳滴定酸度在发酵终点0 h以及4℃条件下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d 和21 d 如图2 所示。

图2 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵乳贮藏时间滴定酸度(TA)的变化Fig．2 The TA of fermented milk with different Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

由图2可知，贮藏过程中各菌株发酵乳的滴定酸度显著升高(P＜0．05)。贮藏0～8 h内滴定酸度上升较快，是由于菌株发酵乳糖产酸较快。朱秋劲报道的发酵乳后熟12 h内是乳酸菌产酸的主要阶段［16］，与本研究的结论基本一致。贮藏前12～48 h内，各菌株发酵乳的滴定酸度增长趋缓。贮藏第7天时，菌株IMAU20706、IMAU20295和 IMAU20423发酵乳的酸度显著高于其他菌株，该3株菌贮藏到21 d时发酵乳的酸度分别为 102．13、105．88 和 95．11 °T。对照菌ND02发酵产品的酸度仅为70．28°T，因此该3株菌的耐酸性强，产生的β-半乳糖苷酶活性好，能够不断产生乳酸，使发酵乳滴定酸度不断升高，是后酸化能力较强的菌株。而菌株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432和 IMAU20360贮藏到21 d时，发酵乳滴定酸度变化较小，表明这4株菌在贮藏期间的后酸化能力较弱。

3.3 发酵乳乙醛含量变化

乙醛是酸奶风味物质中最主要的成分，发酵乳中乙醛的含量是评价酸奶质量的重要指标之一。目前，国内生产的酸奶主要是以乙醛风味为主的醛香型酸奶。Handan［17］指出高含量乙醛是形成发酵乳良好风味的前提，在5～21 μg/g范围内乙醛含量越高对发酵乳的风味越有利。Sandine等［18］报道过，在发酵乳中乙醛的浓度只有高于8 μg/g时，才能产生具有良好风味的发酵乳。刘宁宁［19］等人研究报道发酵乳乙醛含量5 mg/L可品尝到，质量含量超过30 mg/L时，会使酸奶产生不愉快的风味。本研究乙醛含量测定结果如图3所示。

图3 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵乳贮藏时间乙醛产量的变化Fig．3 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

从图3可以看出，发酵乳乙醛含量24～36 h内达到峰值，之后随着贮藏时间的延长而下降。Beshkova报道，发酵乳乙醛含量后熟期间一直处于增长状态，在22 h达到其峰值，而不同菌株，其含量达峰值时间有一定差别，大致在22～31 h［6］，本研究所得结论基本与此一致。菌株IMAU20706和IMAU20295分别在贮藏 24、36 h时达到峰值(含量为 41．53、48．61 μg/g)，贮藏期间第7天其乙醛含量仍在30 μg/g以上。这2株菌乙醛含量过高，对酸奶风味不利，会使酸奶产生不愉快的风味。对照菌ND02乙醛含量变化在4．39～9．69 μg/g之间。菌株IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432 和 IMAU20360乙醛含量变化在5～15 μg/g之内，认为是风味较好的菌株，尤其菌株IMAU20775乙醛含量变化在9．00～13．47 μg/g之间，高于菌株IMAU20234、IMAU20432和IMAU20360。而菌株IMAU20423乙醛含量在整个过程中都低于4 μg/g，该菌被认为是极弱风味菌种，不适合做发酵剂菌种。

3.4 发酵乳双乙酰含量变化

不同 Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵的发酵乳在发酵终点0 h以及4℃下后熟8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、7 d、14 d和21 d的双乙酰含量如图4所示。

图4 不同Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus发酵乳贮藏时间乙醛产量的变化Fig．4 The acetaldehyde content of Lb．delbrueckii ssp．bulgaricus strains during storage time

从图4可以看出，不同菌株发酵的发酵乳双乙酰含量之间存在着差异，菌株双乙酰含量随贮藏时间的延长变化规律有所不同，菌株 IMAU20295、IMAU20423和ND02发酵乳双乙酰含量发酵终点时达到峰值，随着贮藏时间的延长下降，贮藏到21 d时又有 所 上 升。菌 株 IMAU20234、IMAU20775、IMAU20432、IMAU20360和 IMAU20706发酵乳双乙酰含量随着贮藏时间的延长上升达到峰值，然后开始下降，贮藏到第14天、21天时又有上升的趋势，这与Marshall［20］报道，低pH有利于双乙酰合成，本研究得出的结论与此一致。康欢［21］等也有类似报道，随着pH的降低和酸度的增加，双乙酰含量随之增加。研究发现产品中2 μg/mL的双乙酰即可表现出特有的奶油香味［22］，与对照菌株ND02比较，将在贮藏期间产双乙酰量高于2 μg/mL，且在后熟期间含量较稳定的菌株为IMAU20775，是开发商业发酵剂的潜在菌株。

4 结论

通过对11株保加利亚乳杆菌菌株在发酵乳发酵过程以及4℃贮藏 0、8、12、24、36、48 h、7、14 d和21 d期间的pH值、滴定酸度，产乙醛和双乙酰能力等一系列指标的测定及评价，同时记录每种保加利亚乳杆菌的发酵时间并对测定的结果进行分析，筛选出1株发酵特性优良的菌株IMAU20775，其发酵时间较短(12．38 h);后酸化能力较弱，4℃贮藏21d后滴定酸度的仅为70．56°T;产乙醛能力较好，发酵乳乙醛含量变化在9．00～13．47 μg/g;另外，发酵乳后熟期间产双乙酰含量在 1．85～3．04 μg/mL 之间，且较稳定。IMAU20775所具有的优良发酵特性可作为研制开发优良发酵乳及发酵饮料的发酵剂菌种。

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