超声波协助提取绿豆分离蛋白的研究

张玉霞，雍国新，黎渊珠，梁琼

（1．海南工商职业学院应用技术系，海南海口570203；2．海口经济学院工程技术学院，海南海口 570203）

近年来，世界人均蛋白质的年供给量逐年有所增加，但多数来自动物蛋白。与动物蛋白相比较，植物蛋白具有以下优点：第一，植物蛋白低脂肪无胆固醇，可有效防止动物蛋白所导致的肥胖、肿瘤和心脑血管疾病的发生；第二，我国人多地少，粮食转化为动物蛋白的效率低，而植物蛋白的生产成本仅为动物蛋白的15%左右；第三，将植物蛋白制品作为食品添加剂，可起到氨基酸互补的作用，是一种极具市场潜力的功能性保健食品[1]。鉴于此，开发植物蛋白成为该领域的热点研究之一。

绿豆别名植豆、青小豆、吉豆，为豆科一年生草本植物。绿豆中富含蛋白质和糖类，也含有丰富的钙、磷、铁及维生素等。绿豆中蛋白质含量高达19.5%～33.1%，蛋白质功效比高，且氨基酸种类齐全，尤其以赖氨酸含量较为丰富，接近鸡蛋蛋白质赖氨酸含量[2]。另外，绿豆蛋白具有优良的溶解性、保水性、乳化性、凝胶性、发泡性和泡沫稳定性等功能特性[3]，在食品加工业的面制品、肉制品、乳制品和饮料中的应用前景十分广阔。利用分离蛋白制成的蛋白奶、咖啡豆奶、豆奶酪、果汁豆奶等蛋白饮料，不仅具有较高的营养价值，而且品质优良、味道鲜美，深受广大消费者的欢迎。目前，大多数生产厂家都侧重于绿豆淀粉的加工，而忽略了绿豆蛋白的开发，只是把它作为生产废料或牲畜饲料，造成绿豆资源浪费，增加绿豆淀粉生产成本，使其在价格竞争上更为不利。因此，开发生产绿豆分离蛋白更具有重要的社会意义和显著的经济效益。

目前，绿豆分离蛋白的提取研究仍以碱提酸沉法为主，然而，传统碱提取绿豆分离蛋白不仅效率低，纯度低，而且耗时，生产成本高。近来，有报道用酶法提取绿豆分离蛋白，尽管酶法可以提高效率，但酶价格昂贵，易失活，提取过程较难控制，生产成本也较高。

超声技术是一种新型的物理提取方法。超声波能够产生增溶作用而被广泛应用于目的物质的强化提取，具有成本低、设备简单、操作容易、提取效率高和提取时间短等优点，已有应用超声提取大豆蛋白、棉籽蛋白、玉米蛋白以及小麦蛋白的报道，但鲜见超声提取绿豆分离蛋白的研究。因此，本课题将探讨超声波协助提取绿豆分离蛋白的最佳提取工艺条件[3]。

1 材料与实验方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试剂与材料

绿豆：临绿一号（十八罗汉），种子公司购买。三（羟甲基）氨基甲烷，氯化钠，盐酸，牛血清白蛋白，考马斯亮蓝（G250），85%正磷酸，95%乙醇，石油醚均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器

酸度计（PHS—3C）、JB-1定时双向磁力搅拌器：金坛市荣华仪器制造有限公司；KQ-50型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LG-24A型高速离心机：北京医用离心机厂；电子分析天平（JA1203N）：上海精密科学仪器有限公司；TGL-16G-A高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-7504c紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；索氏抽提器：上海贝特仪电设备厂；微量移液器：北京正兴宏业生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿豆分离蛋白的提取流程

绿豆分离蛋白的碱提取[1]：绿豆粉→脱脂→浸提→离心分离→上清液蛋白质提取率测定。

绿豆分离蛋白的超声波法协助提取[4-6]：绿豆粉→脱脂→超声波处理→离心分离→上清液蛋白质提取率测定。

1.2.2 绿豆粉的制备

挑拣无干瘪及生虫的绿豆，放于洁净的培养盘中，用自来水冲洗两三次后，再用蒸馏水洗两三次。用滤纸吸去多余水分后在室温下自然风干。用粉碎机将干燥的绿豆粉碎，过筛去除杂质。将收集的绿豆粉装入烧杯中储存在4℃冰箱中备用。

1.2.3绿豆粉的脱脂——索氏提取器去除油脂[7]

采用索氏提取器去除油脂。

1.2.4 绿豆分离蛋白的碱法提取

准确称取4 g脱脂绿豆粉于40℃的60 mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃下恒温搅拌40 min后，4000 r/min离心15 min，再将离心液用快速滤纸过滤除去漂浮物，用考马斯亮蓝法测定滤液中的绿豆分离蛋白含量。

1.2.5 超声波协助提取绿豆分离蛋白

1.2.5.1 超声处理时间对绿豆分离蛋白提取率的影响

准确称取6份4 g脱脂绿豆粉，分别设定料液比为1∶15（g/mL），pH 为 9.0，温度为 40℃，超声波功率为50 W，超声处理时间分别为 10、20﹑30、40﹑50、60 min，将浸提液 4000 r/min离心15 min，取上清液，测定其蛋白质含量。

1.2.5.2 温度对绿豆分离蛋白提取率的影响

准确称取5份4 g脱脂绿豆粉，分别设定料液比为 1 ∶15（g/mL），pH 为 9.0，温度分别为 30、35、40﹑45、50℃，超声波功率为50 W，超声处理时间为20 min后，将浸提液 4000 r/min离心15 min，取上清液，测定其蛋白质含量。

1.2.5.3 料液比对绿豆分离蛋白提取率的影响

准确称取5份4 g脱脂绿豆粉，分别设定料液比为 1∶10、1∶15、1 ∶20、1∶25、1 ∶30 g/mL，pH 为 9.0，温度为45℃，超声处理时间为20 min，超声波功率为50 W，将浸提液 4000 r/min离心15 min，取上清液，测定其蛋白质含量。

1.2.5.4 pH对绿豆分离蛋白提取率的影响

准确称取5份4 g脱脂绿豆粉，分别设定料液比为 1 ∶10（g/mL），pH 分别为 7.6、7.9、8.2、8.5、8.8，温度为45℃，超声处理时间为20 min，超声波功率为50 W，将浸提液 4000 r/min离心15 min，取上清液，测定其蛋白质含量。

在单因素试验的基础上进行L9（34）正交试验，以便得出绿豆分离蛋白的最佳超声提取条件。

1.2.6 可溶性绿豆分离蛋白的测定—考马斯亮蓝G250染色法

取7支干净的试管，按表1进行编号并加入试剂。混匀，室温静置3 min，以第一管为空白，于波长595 nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（μg/mL）作为横坐标作图得标准曲线。

表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备Table 1 The preparation of protein creational curve

另取一支干净的试管，加入样品液2.0 mL及考马斯亮蓝染液8.0 mL，混匀，室温静置3 min，于波长595 nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线求出蛋白质含量。

1.2.7 绿豆分离蛋白提取率计算[8]

测定总提取液中的水溶性蛋白含量及原料蛋白质含量——考马斯亮蓝法。

2 实验结果与分析

2.1 牛血清蛋白的标准曲线的制作

根据Bradford法制得标准曲线见图1。

图1 牛血清蛋白的标准曲线Fig.1 The standard curve of ox blood albumen

标准工作曲线：y=0. 0825+0. 00834x（R=0. 99438）。

2.2 超声波提取绿豆分离蛋白单因素试验结果与分析

2.2.1 超声处理时间对绿豆分离蛋白提取率的影响

超声处理时间对绿豆分离蛋白提取率的影响见图2。

图2 超声时间对提取率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extracting ratio of protein

由图2可知，超声处理时间为10 min～20 min内，随着超声波处理时间的延长，提取率不断增加，超声波处理20 min时提取率最高。这可能是由于在这段时间内，随着时间的延长，形成的气泡越多，高频振荡越剧烈，吸收的声能越大，破壁的效果越好，蛋白质溶出也越多。而超过20 min后，随着时间的延长，提取率反而不断下降，这可能是由于超声波的强烈振动及热效应作用导致蛋白变性，从而使蛋白水溶性变差。

2.2.2 温度对绿豆分离蛋白提取率的影响

温度对绿豆分离蛋白提取率的影响见图3。

图3 温度对蛋白质提取率的影响Fig.3 The effect of temperature on the extracting ratio of protein

由图3可知，在35℃～45℃之间，随着温度的升高，提取率不断上升，在45℃达到最高，所以实验条件范围内选提取温度是45℃。原因是温度升高至一定程度会导致蛋白质变性，蛋白质分子展开后，由于疏水基的暴露和蛋白质分子相互缠绕而使溶解度降低。

2.2.3 料液比对绿豆分离蛋白提取率的影响

料液比对绿豆分离蛋白提取率的影响见图4。

图4 料液比对提取率的影响Fig.4 The effect of the ratio of water on the extracting ratio of protein

由图4可知，提取率在 1∶10（g/mL）达到最高，所以实验条件范围内选提取料液比为1∶10（g/mL）。随着料液比的减小，提取率不断下降。这是由于液体量的增加使蛋白质最大限度的溶解，高料液比使得提取液的蛋白质浓度太低，从而降低了蛋白提取率。

2.2.4 pH对绿豆分离蛋白提取率的影响

pH对绿豆分离蛋白提取率的影响见图5。

图5 pH对蛋白质提取率的影响Fig.5 The effect of pH on the extracting ratio of protein

由图5可知，蛋白质的提取率随提取液pH的升高而提高，在pH为8.5时提取率最高，所以实验条件范围内选提取pH为8.5，之后提取液pH继续增大提取率反而下降。这是由于碱性过强易造成蛋白质的变性，使蛋白的水溶性变差。

2.3 L9（34）正交试验结果与分析

2.3.1 正交试验水平设计[9]

以单因素试验为基础，在超声波功率为50 W的条件下，以超声-碱提法的提取温度、超声提取时间、提取液pH、料液比为考察因素，各因素取三水平进行正交试验，不考虑各因素间的交互影响，以绿豆分离蛋白的提取率为考察指标，筛选最佳提取条件，因素-水平设计见表2，试验结果见表3。

表2 超声波处理正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test onultrasonics treatment

表3 超声波提取正交试验结果与极差分析Table 3 Results of orthogonal test on supersonic extraction

通过由表3极差分析结果可知，在实验设计的范围内，超声波协助提取绿豆粉粒蛋白的最佳条件为：超声提取时间 25 min、提取温度 45℃、料液比 1∶12（g/mL）、溶液pH8.5。各因素对蛋白质提取率影响大小的次序为C﹥A﹥B﹥D，即：料液比﹥超声提取时间﹥提取温度﹥pH。

2.3.2 验证试验

进行超声波辅助碱液提取的验证试验3次，测得蛋白质提取率为95.1%。与正交试验最高提取率94.2%相比，提高了0.9%。

2.4 超声波法与传统方法的比较

超声波法与传统方法的比较见表4。

表4 超声波法与传统方法的比较Table 4 Ultrasonic contrast with traditional methods

通过表4的比较可以看出，超声波辅助碱液提取与单纯碱液提取法相比，蛋白提取率提高10.08%。超声处理使提取时间缩短了15 min，超声波法所用料液比增大。因此，采用超声波辅助碱液提取可以提高绿豆分离蛋白的提取率和提取速率，提高了效率，节省了成本。

3 结论

1）以脱脂绿豆粉为原料，采用超声波辅助碱液提取法提取绿豆分离蛋白，通过单因素和正交试验，得出最适提取条件为：超声波时间为25 min、温度为45 ℃、料液比为 1∶12（g/mL）、溶液 pH8.5，蛋白质的提取率为95.1%。

2）采用超声波辅助碱液提取可以提高绿豆分离蛋白的提取率和提取速率。与单纯碱液提取法相比，提取率提高了10.08%。超声处理使提取时间缩短了15 min，且料液比降低，大大提高了效率，节省了成本。

3）探索新的提取工艺技术，提高提取效率和工业化实施的可行性尤为重要。超声波协助提取作为一种有效提取方法，具有简单、方便、快速和安全等优点，在生物的有效成分提取中得到了广泛应用。

4）超声技术在协助提取中有广阔的应用前景，进一步开展该技术的研究，使超声技术向有利于工业化大生产的方向发展，具有理论意义和实际的应用价值。超声波与传统方法可以很好地结合起来，只是在步骤中加入超声波处理程序。

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