松仁红衣多酚的提取及体外抗氧化活性研究

张根生，侯 静，张铭东，司淼菲

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076)

植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物［1］，广泛存在于植物的皮、根、果中，含量可达20%［2］。近年来，研究表明松属植物含有大量多酚类化合物，其具有独特的化学性质和生物活性，统称为松多酚［3］。松多酚的酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化成醌类化合物，对活性氧等自由基有较强的捕捉能力［4］，使得松多酚具有抗氧化活性［5］，此外松多酚还具有抗肿瘤［6］、降血脂、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病［7］等多种生理功能，在食品、医药以及其他领域起到了一定的作用［8-9］。

松多酚的提取方法主要有机溶剂浸提、超声波辅助和酶法辅助有机溶剂提取法等。采用超声波辅助有机溶剂提取法提取松多酚是最常用的，该方法利用了超声波的空化效应，通过对细胞壁产生影响及促进细胞溶胀等，强化了提取过程，缩短了提取时间［10］，使植物活性成分溶出，并且温度不会大幅度升高，不会破坏其有效成分［11］。赵玉红等比较了樟子松树皮中松多酚的提取方法，研究表明超声波辅助提取法的提取效果好于有机溶剂提取法［3］。苏晓雨采用超声波辅助提取了红松种壳中多酚类化合物，研究表明松壳多酚能够有效的抑制羟自由基及超氧阴离子等生理性自由基，能够显著地清除DPPH自由基及ABTS等非生理性自由基［12］。

以松仁生产过程中废弃的松仁红衣为原料，采用超声波辅助有机溶剂浸提法，提取松仁红衣中的粗多酚，优化提取工艺条件，并研究其体外抗氧化活性，为充分利用红松籽可食用资源及寻找新型天然抗氧化剂提供了一个新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松仁红衣 勃利县宏泰松果有限公司;无水碳酸钠 天津市双船化学试剂厂;乙醇 天津基准化学试剂有限公司;没食子酸 天津市光复精细化工研究所;福林酚 天津市光复精细化工研究所;抗坏血酸 天津市天新精细化工开发中心;硫代硫酸钠 天津市科密欧化学试剂有限公司;DPPH Aladdin公司;碘化钾 天津市北方天医化学试剂厂;钼酸铵 天津市化学试剂四厂;30%过氧化氢 哈尔滨新达化工厂;水杨酸钠 天津市光复精细化工研究所，以上试剂均为分析纯。

Y92-2D超声波细胞粉碎仪 宁波新知生物科技股份有限公司;721E型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1．2．1 提取工艺流程 松仁红衣→粉碎→超声波辅助乙醇溶剂浸提→冷却→抽滤→松仁红衣多酚提取液

将松仁红衣干燥，经粉碎机粉碎，过40目筛。每份称取1g松仁红衣粉末，加入一定量的乙醇溶剂，进行超声波辅助提取，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间、超声功率为变量，进行单因素实验。提取结束后冷却并抽滤，得到松仁红衣多酚粗提液。将滤液定容至一定体积，用福林酚比色法测定吸光度，并计算多酚得率。根据单因素实验结果，进行正交实验，对松仁红衣多酚提取条件进行优化。

1．2．2 福林酚法测定松仁红衣多酚含量 参考文献［13］进行实验。

1．2．2．1 标准曲线的绘制 没食子酸标准储备溶液(1000μg/mL):称取(0．110 ±0．01)g 没食子酸(GA，相对分子质量188．14)，于100mL容量瓶中溶解并定容至刻度，摇匀(现配)。没食子酸工作液:用移液管分别移取 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL 的没食子酸标准储备溶液于100mL容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀，浓度分别为 10、20、30、40、50μg/mL。

标准曲线的确定:用移液管分别移取没食子酸工作液、水(做空白对照)各1．0mL于10mL棕色容量瓶中，分别加入5．0mL 10%福林酚试剂，摇匀。反应3～8min内，加入 4．0mL 7．5% 的 Na2CO3溶液，充分混匀后定容。置于25℃恒温水浴中反应1h后，用10mm比色皿于765nm波长下测定吸光值。以没食子酸的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制没食子酸标准曲线。

1．2．2．2 样品的测定 样品测定方法:精密吸取1mL样品溶液于10mL棕色容量瓶中，再分别加入5．0mL10%福林酚试剂，摇匀。反应3～8min内，加入4．0mL7．5%的 Na2CO3溶液，充分混匀后定容。置于25℃恒温水浴中反应1h后，用10mm比色皿于765nm波长下测定吸光值。由标准曲线上查得相对应的浓度，按下式计算出多酚粗提物的得率:

式中:C为多酚质量浓度(mg/mL);V为提取液的体积mL;M为样品质量g。

1．2．3 松仁红衣多酚提取工艺单因素实验

1．2．3．1 乙醇浓度对松仁红衣多酚粗提物得率的影响 精确称取(1±0．0001)g松仁红衣粉末5份，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，按料液比1∶20，提取温度60℃的条件超声波提取90min，超声功率300W，提取结束后抽滤，取滤液按照福林酚法测定多酚粗提物得率［12，14］。

1．2．3．2 料液比对松仁红衣多酚粗提物得率的影响 精确称取(1±0．0001)g松仁红衣粉末5份，分别按料液比 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 用浓度为 50%的乙醇溶液超声波提取90min，提取温度60℃，超声功率300W，提取结束后抽滤，取滤液按照福林酚法测定多酚粗提物得率。

1．2．3．3 提取温度对松仁红衣多酚粗提物得率的影响 精确称取(1±0．0001)g松仁红衣粉末5份，料液比1∶20，乙醇浓度50%，分别在30、40、50、60、70℃温度条件下超声波提取90min，超声功率300W，提取结束后抽滤，取滤液按照福林酚法测定多酚粗提物得率。

1．2．3．4 超声时间对松仁红衣多酚粗提物得率的影响 精确称取(1±0．0001)g松仁红衣粉末5份，料液比1∶20，乙醇浓度50%，在60℃下分别超声波提取30、60、90、120、150min，超声功率 300W，提取结束后抽滤，取滤液按照福林酚法测定多酚粗提物得率。

1．2．3．5 超声功率对松仁红衣多酚粗提物得率的影响 精确称取(1±0．0001)g松仁红衣粉末5份，料液比1∶20，乙醇浓度50%，提取温度60℃，分别在超声功率 200、250、300、350、400W 下提取时间 90min，提取结束后抽滤，取滤液按照福林酚法测定多酚粗提物得率。

1．2．4 松仁红衣多酚提取工艺正交实验 根据单因素实验的结果，选择乙醇浓度、料液比、提取温度、超声时间为正交实验因素，设计3个水平，以多酚的得率为指标，选用L9(34)正交表优化实验方案，确定最佳提取工艺。

1．2．5 松仁红衣多酚体外抗氧化活性实验

1．2．5．1 松仁红衣多酚清除羟自由基能力测定 吸取 0．5mL 浓度为8mmol/L 的 FeSO4溶液，0．8mL 浓度为6mmol/L 的 H2O2溶液，0．5mL 蒸馏水，1．0mL 不同浓度的松仁红衣多酚提取物，0．2mL浓度为20mmol/L水杨酸钠溶液。混合摇匀后于37℃水浴中反应1h，然后于562nm波长下测定混合物吸光度值A1;将上述体系中的1．0mL松仁红衣多酚提取物用蒸馏水代替，其余同法操作，测定吸光度值A0;将上述体系中的0．2mL水杨酸钠溶液用相同体积的蒸馏水代替，其余同法操作，测定吸光度值A2。以抗坏血酸为阳性对照，同等方法操作进行测定［15］。记录各项吸光度值，按照下式计算松仁红衣多酚提取物及抗坏血酸对羟自由基的清除率:

式中:S为羟自由基清除率(%);A1为混合物吸光度值;A2为上述体系中水杨酸钠溶液用等体积蒸馏水代替测定吸光度值;A0为上述体系中样品用等体积蒸馏水代替测定吸光度值。

1．2．5．2 松仁红衣多酚清除 DPPH自由基能力测定 将DPPH·粉末配制浓度为8．62×10-2mmol/L的DPPH·乙醇溶液保存于棕色瓶中(临用前配)。向比色管中加入 2．0mL DPPH·乙醇溶液，2．0mL 不同浓度松仁红衣提取物，摇匀，室温下避光静置30min，然后在517nm波长处测定吸光度值A1;同法操作，用等体积乙醇代替松仁红衣提取物，测定吸光度值A0;不加DPPH·溶液，用等体积乙醇代替，加入不同浓度松仁红衣提取物，测定吸光度值A2，用以排除样品本身对测定结果的干扰。以抗坏血酸作为阳性对照品，以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作样品浓度与DPPH自由基清除率关系曲线［16］。按照下式计算松仁红衣多酚提取物及抗坏血酸对DPPH自由基的清除率:

式中:S为DPPH·清除率(%);A1为混合物吸光度值;A2为上述体系中DPPH·溶液用等体积乙醇代替测定吸光度值;A0为上述体系中样品用等体积乙醇代替测定吸光度值。

1．2．5．3 松仁红衣多酚清除过氧化氢能力测定 吸取1．0mL0．1mmol/L的 H2O2溶液于10mL比色管中，再加入3%钼酸铵溶液0．1mL，2mol/L的H2SO4溶液10mL，1．8mol/L 的碘化钾溶液 7．0mL，不同浓度的松仁红衣提取物1．0mL，混合摇匀后静置片刻。用5mmol/L Na2S2O3溶液滴定上述混合溶液，滴定终点为溶液的黄色消失［17］。按照下式计算过氧化氢清除率，清除率表示加样后过氧化氢的减少量占对照组过氧化氢总量的百分比:

式中:S为过氧化氢清除率(%);V0为对照组消耗Na2S2O3溶液的体积(mL);V1为样品组消耗Na2S2O3溶液的体积(mL)。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线及回归方程

没食子酸在0～50μg/mL浓度范围内的线性回归方 程为:y=0．0063x+0．0008，相关 系数 R2为0．9997，表明该浓度范围内线性关系良好。

2.2 松仁红衣多酚提取工艺的单因素实验

2．2．1 乙醇浓度对松仁红衣多酚得率的影响 由图2可知，在乙醇浓度小于50%时，多酚得率随乙醇浓度增大而呈上升趋势，当乙醇浓度达到50%时多酚的得率达到最高，之后随着乙醇浓度的增加，多酚得率略微下降，原因可能是随着乙醇浓度的增大，多酚在乙醇水溶液中的溶解度增大，在乙醇浓度50%达到最大，然而随后增加乙醇浓度，溶剂中的水分减少，通透性降低，细胞内的多酚物质向外扩散难度加大，所以提取率低［18］。因此确定乙醇浓度50%为最佳浸提条件，选取优化范围为40%～60%。

图1 没食子酸标准曲线Fig．1 The standard curve of gallic acid

图2 乙醇浓度对松仁红衣多酚得率的影响Fig．2 Effects of ethanol concentration on polyphenols yield of Pine Nut Coat

2．2．2 料液比对松仁红衣多酚得率的影响 由图3可知，从料液比1∶15开始，随着料液比的加大，多酚得率呈现先升高后降低的趋势，当料液比为1∶20时，多酚得率较1∶15时明显升高，之后逐渐平稳，变化不大，考虑后续的浓缩处理及经济成本等多方面原因，确定料液比1∶20为最佳浸提条件，选取优化范围为1∶15～1∶25。

图3 料液比对松仁红衣多酚得率的影响Fig．3 Effect of material-to-liquid ratio on polyphenols yield of Pine Nut Coat

2．2．3 提取温度对松仁红衣多酚得率的影响 由图4可知，提取温度低于60℃时，随着温度的升高，松仁红衣多酚得率逐渐提高，在温度达到60℃时多酚的得率达到最大，随后略有下降。这是由于多酚类化合物在高温条件下很不稳定，易受到破坏;而温度过低不利于超声的空化作用，因此也会降低多酚的提取效果［19］。综合考虑，确定最佳提取温度为60℃，选取优化范围为40～60℃。

图4 提取温度对松仁红衣多酚得率的影响Fig．4 Effect of extraction temperature on polyphenols yield of Pine Nut Coat

2．2．4 超声时间对松仁红衣多酚得率的影响 由图5可知，当超声波作用时间为60min时，多酚粗提物得率较低，随着提取时间的延长，松仁红衣多酚粗提物得率呈上升趋势，在120min时达到最高。这是由于提取时间长有利于多酚物质溶解入溶剂中，使提取更加完全;当提取时间超过120min时，得率略微下降。因此，确定最佳提取时间为120min，选取优化范围为90～150min。

图5 超声时间对松仁红衣多酚得率的影响Fig．5 Effect of ultrasonic time on polyphenols yield of Pine Nut Coat

2．2．5 超声功率对松仁红衣多酚得率的影响 由图6可以看出，超声功率低于300W时，随着超声功率的增加，松仁红衣多酚得率逐渐升高，功率达到300W时得率最大，此后，随着超声功率的增加，得率略有下降，但整体水平对得率的影响不显著。原因可能是超声波使细胞破裂，提高功率，细胞破裂加剧，从而有利于多酚类物质的溶解;但当超声波功率超过一定限度时，便可能会破坏多酚类物质的结构，从而造成得率下降［20］。因此选择300W为最佳提取超声功率。

图6 超声功率对松仁红衣多酚得率的影响Fig．6 Effect of ultrasonic wave power on polyphenols yield of Pine Nut Coat

2.3 松仁红衣多酚提取工艺的正交实验

为了确定松仁红衣多酚提取的最佳工艺，根据单因素的实验结果，设计了四因素三水平的正交实验，具体设计及结果见表1。

由表1可知，各因素对松仁红衣多酚得率影响程度的大小次序为A＞B＞D＞C，即乙醇浓度＞料液比＞超声时间＞提取温度，最佳提取工艺参数为A3B2C2D1，即乙醇浓度 60%，料液比 1∶20，提取温度60℃，超声时间90min，在此条件下进行验证实验，得到松仁红衣多酚得率为2．36%。

表1 正交实验设计及结果Table 1 Results of orthogonal test of polyphenols extraction

2.4 松仁红衣多酚的抗氧化活性

2．4．1 松仁红衣多酚清除羟自由基的能力 实验结果如图7所示，松仁红衣多酚与抗坏血酸对羟自由基均具有一定清除作用，在一定浓度范围内，随着浓度的增加，两者的清除率都在提高，当松仁红衣多酚样品浓度达到0．5mg/mL时，其清除率达到56．23%。羟自由基已被研究证明对活细胞中各种分子具有损伤作用，能够导致DNA链断裂，产生基因突变等［21］，该实验结果表明松仁红衣多酚具有清除羟自由基的作用，所以在防治自由基引发的疾病、延缓机体衰老等方面具有重要意义。

图7 松仁红衣多酚及抗坏血酸对羟自由基清除作用Fig．7 The·OH scavenging activity of Pine Nut Coat polyphenols extract and ascorbic acid

2．4．2 松仁红衣多酚清除DPPH自由基能力 实验结果如图8所示，松仁红衣多酚及抗坏血酸对DPPH·均有明显的清除作用，0～0．04mg/mL的浓度范围内，随着松仁红衣多酚样品浓度的增加，清除率不断上升，达到 0．04mg/mL后，其清除率上升缓慢，样品对DPPH自由基清除率最大达到 93．23%，VC达到97．34%。与苏晓雨［12］研究的松壳多酚对DPPH自由基的清除效果基本一致。

图8 松仁红衣多酚及抗坏血酸对DPPH自由基清除作用Fig．8 The DPPH·scavenging activity of Pine Nut Coat polyphenols extract and ascorbic acid

2．4．3 松仁红衣多酚清除过氧化氢能力 实验结果如图9所示，松仁红衣多酚及抗坏血酸对过氧化氢的清除率随着浓度增加而升高。抗坏血酸浓度达到1．4mg/mL时，清除率达到71．21%，之后变化不明显;松仁红衣多酚样品的清除率随着浓度的增加而上升，最大浓度时达到56．73%。虽然松仁红衣多酚的清除率低于抗坏血酸，但在实验浓度范围内，对过氧化氢仍有一定的清除作用，比苏晓雨［12］研究的松壳多酚对过氧化氢的清除效果明显。

图9 松仁红衣多酚及抗坏血酸对过氧化氢清除作用Fig．9 The H2O2scavenging activity of Pine Nut Coat polyphenols extract and ascorbic acid

3 结论

超声波法辅助提取松仁红衣多酚的影响因素主次顺序为乙醇浓度＞料液比＞超声时间＞提取温度，最佳提取工艺:乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取温度60℃，超声时间90min，超声功率300W，在此条件下得到松仁红衣多酚得率为2．36%。

体外抗氧化活性实验研究结果表明，松仁红衣多酚对羟自由基的清除率为松仁红衣多酚样品浓度达到 0．5mg/mL 时，其清除率达到 56．23%;对 DPPH自由基的清除率为当样品浓度达到0．1mg/mL时，最大清除率为93．23%;对过氧化氢的清除率为当样品浓度达到2mg/mL时，清除作用最大达56．73%。由此可见，松仁红衣多酚具有一定的抗氧化性。

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