脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化机制的研究进展

朱振浩等

[摘要] 骨质疏松症（OP）是严重威胁老年人健康的疾病之一。由于OP患者极易发生骨折并发症，严重时可致患者残疾，甚至死亡，因此寻找预防OP的方法已成为了当前研究的一个热点。近年来，脉冲电磁场技术在临床预防OP中起着重要的作用，其中诱导干细胞的成骨分化是其中最重要的机制之一。由于人们对脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化机制认识还不深，本文对近年来脉冲电磁场诱导成骨分化的研究进行归类整理，主要从脉冲电磁场诱导成骨分化相关基因表达、调节干细胞周围的微环境以及促进相关信号通路传导等方面的研究进展作一综述。弄清脉冲电磁场促进干细胞成骨分化的具体机制对将来OP预防具有重要的指导意义。

[关键词] 脉冲电磁场；干细胞；成骨分化

[中图分类号] R687.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（a）-0149-04

Progress of mechanism of pulsed eletromagnetic fields to induce stem cells′osteogenesis differentiation

ZHU Zhenhao1 CHEN Jiale1 CHEN Zhihao1 WU Liqing1 SUN Jia2

1.The Second Clinical Medical College of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China； 2.Department of Endocrinology， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China

[Abstract] Osteoporosis （OP） is one of the serious diseases greatly menacing the old. OP patients are likely to suffer from fracture， even disability and death， which makes the prevention of OP as to a research hot spot. Pulsed eletromagnetic fields plays an important role in the clinical treatment of fracture and the prevention of OP recently， among which the mechanism of inducing stem cells′osteogenesis differentiation is vital. As the general understanding of how pulsed eletromagnetic fields induces stem cells′osteogenesis differentiation is not so profound， this paper organizes and classifies the yearly recent researches of this topic， focusing on the gene expression of osteogenesis differentiation， the regulation of stem cells′microenvironment and the promotion of signal pathway. To clarify how pulsed eletromagnetic fields induces stem cells′osteogenesis differentiation will be of great guiding significance for OP prevention in the future.

[Key words] Pulsed eletromagnetic fields； Stem cells； Osteogenesis differentiation

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以低骨量以及骨组织微结构破坏为特征的一种疾病，多发生于绝经后女性和老年男性，一直是严重威胁老年人健康的疾病之一。随着我国老龄化社会进程的发展，OP患者也逐年增多；据调查，目前我国的OP患者多达5000万人以上[1-3]。OP导致的骨脆性增加将大大增加了患者罹患骨折的风险，因此，OP成为老年人致残的重要因素之一。OP所致的骨折不仅给患者带来了巨大的躯体和精神上的创伤，也给社会及患者家庭带来了沉重的经济负担。目前，脉冲电磁场技术在临床上的骨折治疗以及骨质疏松预防中起着重要的作用，其中诱导干细胞的成骨分化是其中最重要的机制之一。近年来，越来越多的研究表明，脉冲电磁场能够通过多种方式参与干细胞的成骨分化，包括介导相关基因表达、调节干细胞周围的微环境以及促进相关信号通路传导等。弄清脉冲电磁场促进干细胞成骨分化的具体机制不仅能够深化人们对于脉冲电磁场治疗骨质疏松及骨折的认识，对将来骨质疏松预防及骨折治疗也具有重要的指导意义。本文就脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化的具体机制作一综述。

1 脉冲电磁场通过调节相关基因表达参与干细胞的成骨分化

随着基因检测技术水平的不断提高，关于脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化机制研究已经从细胞学水平深入到基因水平。近年来，越来越多的研究表明脉冲电磁场能够通过介导相关基因表达参与干细胞的成骨分化。Runx2/Cbfa1是成骨的关键转录因子，其表达量的高低可以作为早期成骨分化程度的重要指标：①上调成骨分化相关基因的表达；Tsai等[4]研究发现，与未经处理的干细胞相比，经外加脉冲电磁场照射的人间充质干细胞表达的Runx2/Cbfa1及碱性磷酸酶（ALP）量增加，后两者表达上调将有助于骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化。而在Wang等[5]实验发现，除了上调Runx2/Cbfa1、ALP的表达，脉冲电磁场也能够上调干细胞骨形态发生蛋白（BMP）-2、骨钙素等成骨分化基因的表达。②下调干细胞向其他方向分化相关基因的表达；脂肪酶、神经嵴标志物AP-2、过氧化物酶增殖物激活受体（PPARγ）2是干细胞向脂肪细胞分化所表达的重要基因，能够加速干细胞向脂肪细胞的分化。Yang等[6]利用脉冲电磁场（150 Hz，1 mT）处理大鼠骨髓间充质干细胞后发现，干细胞明显向成骨细胞方向分化。进一步通过分析细胞mRNA发现，其表达的Runx2、ALP、BMP2等成骨分化基因上调，而表达的脂肪酶、AP-2、PPARγ 2等向脂肪细胞分化的基因下调。因此，脉冲电磁场一方面能够促进成骨分化基因表达，另一方面抑制其向其他方向分化基因的表达，从而起到诱导干细胞成骨分化的作用。因此，通过研究寻找最适合诱导干细胞成骨分化相关基因表达的场强和频率，对于指导临床治疗骨质疏松及骨折将具有重要的指导意义。

2 脉冲电磁场通过调节干细胞周围的微环境促进其成骨分化

干细胞的增值与分化依赖于其周围特定的微环境改变，而成骨分化微环境涉及众多生长因子以及相关蛋白的表达滴度的变化，如BMP、转化生长因子（TGF）、白介素-11（IL-11）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等。目前，越来越多的研究表明，脉冲电磁场能够促进间充质干细胞周围微环境改变和增加其对微环境低浓度生长因子的敏感性，从而促进其向成骨细胞方向的分化：①调节干细胞周围的微环境。Aaron等[7]通过复习以往的文献发现，脉冲电磁场能够上调干细胞内BMP、转化生长因子（TGF）、白介素-11（IL-11）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等细胞因子及蛋白的表达；后者在通过自分泌和旁分泌等途径被分泌到细胞外，从而改变干细胞周围的微环境，放大成骨分化信号效应，进而促进更多干细胞向成骨细胞方向的分化。②增加干细胞对于微环境低浓度的生长因子的敏感性。Schwartz等[8]根据培养间充质干细胞条件的不同将其分为三个组，分别是：成骨介质组、成骨介质+脉冲电磁场组、成骨介质+BMP+脉冲电磁场组；结果发现脉冲电磁场与BMP能够协同增加干细胞表达的ALP以及骨钙素，且脉冲电磁场能够增加干细胞对于外源性BMP的敏感性，从而促进干细胞向成骨细胞的分化。因此，通过调节干细胞周围的微环境以及增加其对于周围低浓度生长因子的敏感性可能是脉冲电磁场促进干细胞成骨分化的重要机制。而通过外源性的增加一种或多种生长因子，结合脉冲电磁场增加干细胞对生长因子的敏感性可能是未来预防骨质疏松和治疗骨折的一种策略。

3 脉冲电磁场通过调控相关的信号通路促进干细胞成骨分化

干细胞的成骨分化涉及了众多的信号通路传导，包括环腺苷酸激活蛋白激酶A（cAMP-PKA）信号通路、细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路等。目前，越来越多研究表明脉冲电磁场诱导干细胞分化成骨机制可能是通过影响相关的成骨分化信号传导实现。但目前关于这方面的研究还没有定论，很多学者都对脉冲电磁场诱导干细胞成骨分化的机制提出了多种假说。当前普遍接受的有以下四条信号通道假说：

3.1 脉冲电磁场通过调控cAMP-PKA信号通路促进干细胞成骨分化

作为促进成骨分化最重要的信号通路之一，cAMP-PKA信号通路通过增加细胞内磷酸化cAMP水平使蛋白酶A磷酸化，进而激活下游相关的信号通路传导，从而促进成骨所需生长因子如IL-11、IGF-1、BMP-2等的表达，最终以自分泌或旁分泌的形式促进干细胞的增殖分化[9]。近年来研究表明：脉冲电磁场可能是通过激活cAMP-PKA信号通路，从而促进干细胞向成骨细胞方向分化[10]。任凯等[11]采用频率为50 HZ、场强为2 mT的电磁场刺激间充质干细胞，结果显示cAMP表达水平上调、成骨细胞分化程度增高。相关研究还证实：当用蛋白激酶A（PKA）特异性抑制剂H89作用于经脉冲电磁场处理的间充质干细胞后，其ALP的表达量明显降低，细胞成骨分化程度也明显降低[9]。这说明脉冲电磁场可能是通过调控cAMP-PKA信号通路传导从而促进间充质干细胞的成骨分化。相反，通过给予PKA抑制剂则能够抑制脉冲电磁场对cAMP-PKA信号通路传导的影响，从而抑制干细胞的成骨分化。研究还显示：在脉冲电磁场照射干细胞的早期，成骨分化的标志物ALP表达水平提高，钙沉淀增加；但当场强增大到一定程度之后干细胞的分化程度反而降低[12]。提示脉冲电磁场促进干细胞成骨分化与场强有一定的关系。因此，选择一个合适场强和频率的脉冲电磁场对于其临床应用具有重要意义，有待人们更加深入的探索研究。

3.2 脉冲电磁场通过调控PI3蛋白激酶-Akt-mTOR信号通路促进干细胞成骨分化

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）信号是指PI3K和其下游分子蛋白激酶B（PKB或Akt）所组成的信号通路，与人类肿瘤的发生发展密切相关。近年研究表明PI3蛋白激酶-Akt-mTOR信号通路也参与干细胞增殖及其成骨分化等多种功能的调节。该通路通过PI3蛋白激酶使Akt磷酸化，进而激活下游哺乳类动物雷帕霉素（mTOR）；mTOR的激活能够通过核糖体激酶p70S6K和真核细胞启动因子eIF4E结合蛋白（4E-BP-1）两条不同的下游通路，分别控制特定亚组分mRNA的翻译，进而影响相关蛋白质的合成，从而参与干细胞增殖及成骨分化调控。

目前，研究表明脉冲电磁场通过影响PI3k -Akt 信号通路传导从而诱导干细胞的成骨分化。Schwartz等[8]通过观察间充质干细胞整个成骨分化过程发现，脉冲电磁场可能通过PI3k-Akt信号通路促进BMP-2的分泌，进而刺激Runx2基因表达，最终加速间充质干细胞向成骨细胞的分化。相关研究还表明：Runx2基因的表达与Akt间有正反馈调节作用[13]。因此，脉冲电磁场可能通过不断活化的Akt放大该信号通路的作用，最终促进干细胞成骨分化。

目前，探索下游mTOR信号相关蛋白与成骨分化之间的关系是该领域一大研究热点。Patterson等[14]发现脉冲电磁场能够促进mTOR蛋白的活化，进而激活下游的p70S6激酶；后者活化核糖体蛋白S6，最终刺激BMP-4的合成与分泌，同时增加ALP和骨钙素的水平，从而加速干细胞成骨分化。而通过外源性增加PI3的阻滞剂则能够减弱上述信号的传导过程。说明mTOR信号通路可能是PI3蛋白激酶-Akt信号通路的下游通路，其在干细胞成骨分化作用研究还相对较少，具体作用机制有待人们更加深入地研究。

3.3 脉冲电磁场通过调控ERK信号通路促进干细胞成骨分化

作为细胞内的重要组成信号通路，ERK信号通路能够被受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体以及某些细胞因子所激活，其中又以受体酪氨酸激酶受体最为重要。受体酪氨酸激酶是一种跨膜蛋白，分为胞外及胞内段两部分。生长因子与受体酪氨酸激酶胞外段结合后使受体发生二聚体化，从而增加受体的酪氨酸激酶活性，进而使受体本身酪氨酸残基发生磷酸化，最终使胞内段具有酪氨酸激酶的活性。后者能够相继磷酸化Raf、MEK等，最终激活ERK信号通路，从而启动级联反应诱导细胞相关基因表达，进而参与细胞生长、分化的调控。近年研究表明：脉冲电磁场能够通过激活ERK信号通路从而促进间充质干细胞的成骨分化。在Song等[15]探索正弦脉冲电磁场对大鼠间充质干细胞增殖、分化以及矿化作用的研究中发现，经过正弦脉冲电磁场照射（15 Hz，1 mT）后大鼠间充质干细胞Cbfa 1/Runx2、骨唾液蛋白（BSP）、骨桥蛋白（OPN）表达上调，提高ALP活性及细胞钙质的沉积，从而促进干细胞向成骨细胞的分化。进一步实验发现，通过给予ERK信号通路的拮抗剂U0126能够减弱正弦脉冲电磁场对于大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化作用。研究还显示，通过实时定量PCR观察到脉冲电磁场能够促进间充质干细胞内成骨分化相关标志蛋白的表达。同时，Western blot的结果提示ERK信号通路比未经脉冲电磁场处理的间充质干细胞传导活性增强。而利用ERK信号通路阻滞剂PD98059处理后能够降低间充质干细胞成骨蛋白表达，从而抑制干细胞的成骨分化[16]。据此推测，通过激活ERK信号通路可能是正弦脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞成骨分化的重要机制之一。

3.4 脉冲电磁场通过调控Wnt信号通路促进干细胞成骨分化

Wnt信号通路是指由Wnt蛋白为信号分子所介导的级联效应，是近年来分子生物学、细胞生物学以及肿瘤研究中的一大热点，参与了细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育等生命活动的调控。Wnt信号传导通路的信号传递最终取决于细胞胞浆中游离β-cat的浓度，其信号传导过程涉及Fz、LRP5/6、Dsh、GSK-3β等分子，将信号从细胞外传递至细胞内，进而使游离β-cat浓度升高并进入核内，与核内的转录因子淋巴细胞增强因子/T细胞因子（lymphocyte enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）结合，形成β-cat—LEF/TCF转录复合物，从而启动Wnt信号通路下游靶基因的表达，从而参与干细胞的成骨分化[17-18]。近年的研究表明：Wnt信号通路是脉冲电磁场促进间充质干细胞的机制之一。最早关于Wnt信号通路与骨形成的研究是Zhou等[19]完成的，他们通过实时定量PCR发现经脉冲电磁场照射的去卵巢大鼠的Wnt3a、LRP5、β-cat和Runx2表达上调，从而证实激活Wnt通路是脉冲电磁场防治去卵巢大鼠的骨质疏松的机制。相关的研究还证实，除了增加骨量脉冲电磁场还通过激活Wnt信号通路调节去卵巢大鼠的骨微结构和强度。而骨微结构的重塑依赖骨吸收以及骨形成，而这两个过程涉及骨髓间充质干细胞的成骨分化作用[20-23]。有学者利用脉冲电磁场体外照射干细胞2个星期，通过微阵列观察BMP、TGF-β、Wnt信号通路发现：脉冲电磁场可能通过激活Wnt信号通路从而促进成骨分化基因的表达、ALP的活性以及骨小结的形成。在进一步的实验中，通过脉冲电磁场预处理间充质干细胞，使其向成骨细胞分化，从而构建三维骨支架。后者在小鼠颅盖骨缺损的模型中能够加速缺损颅盖骨中的骨形成。预示这种经脉冲电磁场预处理的骨支架在将来骨折修复中可能具有广阔的发展前景。

4 小结与展望

虽然脉冲电磁场具有操作简便、适用范围广、无创和并发症少等优点，并且在临床广泛应用于OP的预防和康复治疗[10]。但仍有很多问题亟待解决，如：脉冲电磁场干细胞成骨效应的最适场强、频率及作用时间还存在着很多争议[24]。目前越来越多的研究表明脉冲电磁场对于干细胞成骨分化有促进作用，人们对于脉冲电磁场促进成骨分化机制有了一定的认识，但其具体机制仍有待更深入的研究。进一步阐明脉冲电磁场促进干细胞成骨分化机制，不仅有助于人们对成骨分化机制的了解，对将来联合骨髓间充质干细胞移植和脉冲电磁场技术的临床应用也具有重要的指导意义。

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（收稿日期：2014-07-18 本文编辑：卫 轲）