脐橙果肉中噻菌灵农药的SERS 快速检测研究

李俊杰，严霖元，刘木华，骆鹏杰，吴瑞梅，王晓彬，陈金印

(1.江西农业大学 工学院，江西 南昌 330045;2.江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045;3.国家食品安全风险评估中心，北京 100022)

噻菌灵(thiabendazole)，又名特克多，属苯并咪唑类，是一种低毒、高效、广谱的内吸性杀菌剂，广泛用于果蔬的防腐保鲜和作物生长期的真菌病害防治等［1］。噻菌灵对人畜均有一定的毒性，在自然状态下降解较慢，若在生产过程中使用不当，容易在水果、蔬菜中残留，对人体健康造成严重威胁。世界各国均制定了噻菌灵的残留限量标准，我国最低残留限量为5 mg/kg，其中脐橙中最大残留量为10 mg/kg［2］。目前噻菌灵农药的常规检测方法有液相色谱法［3-4］、液相色谱-串联质谱法［5］等，但这些方法存在前处理复杂、检测时间长、检测费用高等缺陷。

表面增强拉曼光谱技术(surface-enhanced raman spectroscopy，SERS)比普通拉曼信号强106倍，是一种分子光谱指痕鉴定方法［6-7］，具有检测时间短、前处理简单、检测灵敏度高等优点，在食品和农产品中农药残留、食品添加剂等快速检测方面展现出了巨大的优势［8-9］。Zhang 等［10］利用SERS 技术结合快速溶剂前处理技术，检测豆芽中6-BA 的残留量，方法的最低检测限达到0.02 mg/kg。Zhao 等［11］利用SERS 技术对牛奶中的三聚氰胺进行了定性和半定量检测，其最低检测限为2 mg/L。Gu 等［12］利用表面增强拉曼光谱技术快速测定养殖水中的孔雀石绿，检出限为5 μg/L。Zhai 等［13］利用SERS 方法与化学计量学方法相结合，分析猪尿样中的β 兴奋剂，可检测尿样中的莱克多巴胺的最低浓度达到1 mg/L，检测时间小于30 min。本研究以利用液质联用方法未检测出噻菌灵农药的赣南脐橙为对象，利用SERS技术对噻菌灵的标准溶液和以脐橙果肉提取液为基质的噻菌灵溶液进行研究，采用SPE-C18 反相固相萃取柱消除色素等物质的干扰，实现了对脐橙果肉中噻菌灵农药残留的快速检测，为农业生产安全和农产品的质量安全提供了保障。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

高灵敏度激光拉曼光谱仪RamTracer-200-HS(Opto Trace Technologies，Inc.);电子天平FA1004B型(上海上平仪器有限公司，精度为0.1 mg);液相色谱-质谱联用仪Agilent6490(美国安捷伦科技有限公司);固相萃取装置DG-12B 型(天津市东康科技有限公司);微型离心机(杭州奥盛仪器有限公司);组织捣碎匀浆机JJ-2B 型(江苏省金坛市金南仪器厂);超声波清洗器JK-50B 型(合肥金尼克机械有限公司);超纯水机T10(湖南科尔顿水务有限公司)。

噻菌灵标准品(99%，Sigma-Aldrich 公司);甲醇(色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司);石墨化碳(粒度80～100 目，河北津杨滤材厂);乙腈(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司);氯化钠(99.5%，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司);纳米增强试剂(OTR202、OTR103，欧普图斯(苏州)光学纳米材料有限公司);SPE-C18 反相固相萃取柱(济南博纳生物技术有限公司)。

1.2 噻菌灵标准溶液的配制

准确称取25 mg 噻菌灵标准品，放入250 mL 棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，并定容到刻度，得到浓度为100 mg/L 的噻菌灵标准储备液。再用甲醇将储备液依次稀释成浓度为50，20，10，5，2，1，0.5 mg/L的系列标准溶液。

1.3 脐橙果肉汁的提取及含果肉提取液的噻菌灵溶液配制

实验用脐橙采用液质联用方法检测其是否含有噻菌灵农药，该方法的检出限为10 μg/L，实验结果见图1，图1(a)是浓度为0.05 mg/L 的166 种农药的标准品谱图，图1(b)为脐橙果肉的谱图，其中图1(a)中的插图是噻菌灵特征离子的色谱图，从图可知，噻菌灵农药的出峰时间为4.282 min。图(b)中在4.282 min 未出现谱峰，说明实验脐橙中不含噻菌灵农药。

图1 166 种农药的标准品谱图(a)和脐橙果肉的谱图(b)Fig.1 Grpahs of 166 standard pesticides(a)and navel orange flesh juice(b)

脐橙果肉汁的提取:从中挑选新鲜完整的脐橙，用超纯水冲洗干净，晾干。去皮后，准确称取25 g果肉放入匀浆机中，加入50 mL 乙腈，高速搅拌1 min 后用滤纸过滤。将滤液放入装有6 g 氯化钠的100 mL 具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层，取出澄清液备用。

含果肉提取液的噻菌灵溶液配制:分别移取5 mL 脐橙果汁提取液和浓度为100 mg/L 的噻菌灵标准储备液放入10 mL 离心管中，混合摇匀，得到浓度为50 mg/L 的果汁溶液。

净化:取5 mL 含农残混合液，用固相萃取装置过SPE-C18 反相固相萃取柱，将萃取液移入已加入适量石墨化碳的离心管中，震荡后放入离心机离心2 min，取出离心液，用于拉曼光谱采集。

以同样的方法，分别制备及净化浓度为20，10，5，4，2，1 mg/L 的含果肉提取液的噻菌灵溶液。

1.4 拉曼光谱数据采集

拉曼光谱采集参数为:激发光源波长为785 nm，功率为200 mW，光谱扫描范围400～2 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，积分时间为10 s，积分2 次求平均。取1 个进样瓶，依次向瓶中加入500 μL OTR202 试剂、20 μL 超纯水、100 μL OTR103 试剂混合后，测试增强基底的拉曼信号。另取1 个进样瓶，依次加入500 μL OTR202 试剂、20 μL 甲醇、100 μL OTR103 试剂混合均匀后，采集甲醇溶剂的拉曼光谱信号。再取1 个进样瓶，依次加入500 μL OTR202 试剂、20 μL 含果汁提取液的噻菌灵溶液、100 μL OTR103 试剂混合均匀后，采集含农药残留的脐橙果汁的拉曼信号。

2 结果与分析

2.1 噻菌灵溶液的表面增强拉曼光谱和普通拉曼光谱比较

图2(a)是超纯水的表面增强拉曼谱图，图2(b)是浓度为10 mg/kg 噻菌灵标准溶液的普通拉曼谱图，图2(c)是甲醇溶剂的表面增强拉曼谱图，图2(d)是浓度为10 mg/kg 噻菌灵标准溶液的表面增强拉曼谱图。从图2(a)可看出，表面增强基底的拉曼图谱基本没有谱峰存在，说明实验用表面增强试剂没有基底干拢。从甲醇和噻菌灵溶液的表面增强拉曼光谱图可看出，甲醇存在少量SERS 峰，但峰强较弱且出峰位置与噻菌灵的谱峰不同。由此可见，噻菌灵溶液的表面增强拉曼信号不会受到甲醇溶液背景信号的干拢。对比噻菌灵溶液的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱，其普通拉曼谱图中只有单一谱峰，且峰强不高，而噻菌灵溶液的表面增强拉曼谱图中的谱峰强度较高且谱峰较多，说明纳米增强试剂能有效增强噻菌灵溶液的拉曼信号。图中785，1 010，1 274，1 330，1 562 cm-1这5 处峰强较高，可作为噻菌灵的拉曼特征峰。对这5 处特征峰进行谱峰归属［14-15］:785 cm-1归属于—CSC—非对称伸缩振动和苯环的变形振动;1 010 cm-1的峰强最高，归属于苯并咪唑环的呼吸振动;1 274 cm-1归属于C—H 的面内摆动和苯环的变形;1 330 cm-1归属于C—N 的伸缩振动;1 562 cm-1归属于C—C 的伸缩振动和苯环的变形。这些特征峰可作为噻菌灵农药的定性定量判别依据。

图2 超纯水(a)、甲醇(c)、噻菌灵溶液的普通拉曼光谱(b)和表面增强拉曼光谱(d)Fig.2 SERS of ultrapure water(a)，SERS of methanol(c)SERS of thiabendazole solution(b)and Ordinary Raman spectroscopy of Thiabendazole solution(d)

图3 不同浓度噻菌灵溶液的表面增强拉曼光谱Fig.3 SERS of different concentrations of thiabendazole solutions

2.2 噻菌灵标准曲线制定及线性分析

图3 为不同浓度噻菌灵溶液的表面增强拉曼光谱。由图可看出，随着浓度的减小，其表面增强拉曼信号逐渐减弱，当浓度为1 mg/L 时，785，1 010，1 274，1 330 cm-1处的拉曼信号依然明显，且1 010 cm-1处的拉曼峰强最高，该谱峰归属于苯并咪唑环的呼吸振动，能作为噻菌灵农药的特征谱峰，故以此特征峰制定标准曲线。图4 是以不同浓度的噻菌灵甲醇溶液在1 010 cm-1处的拉曼峰强度制定的标准曲线，由图可看出，1 010 cm-1处的峰强与浓度的线性关系良好，线性方程为y=813.6x+16 268，相关系数R2=0.990 4。

图4 噻菌灵溶液的标准曲线Fig.4 Standard curve of thiabendazole solutions

图5 含脐橙果汁提取液的噻菌灵溶液的表面增强拉曼光谱Fig.5 SERS of different concentrations of thiabendazole solutions with orange juice extract

2.3 脐橙果肉中噻菌灵残留的检测结果与分析

图5 为含脐橙果汁提取液的不同浓度噻菌灵甲醇溶液的表面增强拉曼光谱。由图可看出，随着噻菌灵浓度的降低，拉曼信号的位置几乎没有改变，但是信号强度明显降低。在浓度为5 mg/L 时，784，1 009，1 276 cm-1处的拉曼峰依然明显。当浓度为4 mg/kg 时，与果肉空白的谱峰类似，未出现噻菌灵的拉曼峰。由此判断，采用SERS 方法检测脐橙果肉中噻菌灵农药的最低检测浓度为5 mg/kg。国家标准中规定噻菌灵在脐橙中的最大残留量为10 mg/kg，本方法的最低检测浓度已能满足要求。

3 结论与讨论

本研究采用表面增强拉曼光谱技术快速检测脐橙果肉中的噻菌灵农药残留。以不同浓度的噻菌灵标准溶液的表面增强拉曼光谱中1 010 cm-1处的峰强度建立标准曲线，在1～50 mg/L 具有良好的线性度，其相关系数R2=0.990 4。本方法检测脐橙果肉中的最低浓度为5 mg/kg，低于国家标准中规定的噻菌灵在脐橙中的最高允许残留量10 mg/kg。该方法的样品前处理简单，检测成本低、检测速度快，每个样品的平均检测时间为15 min 左右，为现场快速、大规模的检测柑桔中的农药残留提供了研究基础。

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