一种诊断用谷氨酸脱氢酶酶学性质研究

杜振元

辽宁省朝阳市第二医院检验科，辽宁朝阳 122000

诊断原料用酶的性质是决定酶法试剂质量的关键，因此对临床诊断用酶的酶学性质进行研究具有重要意义[1]。谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GLDH)是生物体代谢途径中一种重要的酶类，谷氨酸脱氢酶可分为NAD 依赖型（EC1.4.1.2）、NAD（P）依赖型（EC1.4.1.3）及NADP 依赖型（EC 1.4.1.4）。酶法尿素氮试剂用到的谷氨酸脱氢酶是NAD 依赖型（EC1.4.1.2），该种谷氨酸脱氢酶一般不太稳定，只有在硫酸铵溶液中才不容易失活[2-3]。谷氨酸脱氢酶可以用于多种生化诊断试剂的配制，谷氨酸脱氢酶是配制尿素氮试剂盒(速率法)所需两种酶之一，尿素氮的含量反应蛋白的分解代谢和肾脏功能[4]。此外，谷氨酸脱氢酶还可用于血氨试剂盒和K 离子试剂盒测定等[5-6]。国内有文献对谷氨酸脱氢酶的酶学性质进行过报道[7]，但是没有说明酶的出处。该文对一种国产谷氨酸脱氢酶的酶学进行研究，证明该种谷氨酸脱氢酶酶学性质符合酶法尿素氮试剂盒的原料用酶要求。

1 材料与方法

1.1 实验材料

谷氨酸脱氢酶由北京迈迪卡科技有限公司生产；NADH 和α-酮戊二酸购于Sigma 公司，Tris 和NH4Cl 是国产生化分析纯试剂；检测仪器是Olympus AU400 全自动生化分析仪器和岛津2450 紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 谷氨酸脱氢酶活力的测定 该法以α-酮戊二酸、铵离子及还原型辅酶I（NADH）为底物，在谷氨酸脱氢酶催化作用下，转变为谷氨酸和氧化型辅酶I（NAD），利用NADH 在340 nm 处有吸收峰，监测其反应速率（-△A/min），计算谷氨酸脱氢酶的活力单位。反应混合液的pH 为8.3，含有0.1 mol/L 的Tris-Cl、0.2 mol/L的氯化铵、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和一定量的酶液。所有酶活测定，如果未作特殊说明，反应体系温度均为37 ℃。

1.2.2 谷氨酸脱氢酶米氏常数的测定 采用Linewaeaver―Burk作图法（双倒数作图法）对谷氨酸脱氢酶的米氏常数进行测定。所有酶活测定，如果未作特殊说明，反应体系温度均为37℃。

2 结果

2.1 谷氨酸脱氢酶pH 稳定性的测定

将一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至pH 为4～12 的缓冲液中，25 ℃条件下放置20 h。其中，pH 4～6 为醋酸缓冲液，pH 6～8 范围为磷酸盐缓冲体系；pH 8～10 为Tris-Cl 缓冲体系，pH10～12 为甘氨酸缓冲体系。然后37 ℃条件下测定残存谷氨酸脱氢酶的活力。实验表明该种谷氨酸脱氢酶具有pH 作用范围广的优点，在pH 为5～10 范围内稳定性较好，酶残存活力在90%以上。见图1。

图1 谷氨酸脱氢酶pH 稳定性

2.2 谷氨酸脱氢酶最适反应温度的测定

温度是影响酶作用的重要因素。酶反应的速度随温度的变化而变化。通常温度每增加10 ℃，酶反应速度增加1～2倍。在一定条件下，每种酶都有一个最适宜的作用温度，在最适温度下酶的活力最高，作用效果最好。为了测定谷氨酸脱氢酶的活力，取一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至pH 为8.3 的0.1mol/L 的Tris-Cl缓冲液中，然后在岛津2450 紫外分光光度计上将反应温度分别调整至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件，试剂保温1 min，然后加入稀释好的谷氨酸脱氢酶测定活力。实验表明该种谷氨酸脱氢酶的最适反应温度是45 ℃。见图2。

图2 谷氨酸脱氢酶最适反应温度的测定

2.3 谷氨酸脱氢酶最适pH 的测定

酶在一定的较狭的pH值范围内表现出最高活力，这个pH值就是酶作用的最适pH值。高于或低于这一pH值，酶的稳定性下降，活性受到影响。为了测定谷氨酸脱氢酶的最适pH，配制如下种类缓冲液：pH 范围为6～7.5 的0.1 M 磷酸钾缓冲液；pH范围为6～7.5 的0.1 M Tris-HCL 缓冲液；pH 范围为8.5～10.5 的0.1 M 甘氨酸缓冲液。以上3种缓冲液中含有0.1 mol/L 的氯化铵、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和7.5 mmol/L 的NADH。取一定量的谷氨酸脱氢酶稀释至pH 为8.3 的0.1 mol/L 的Tris-Cl 缓冲液中。然后37 ℃条件下测定谷氨酸脱氢酶在不同pH条件下的活力。实验结果表明谷氨酸脱氢酶最适pH值是7.5，实验结果见图3。

图3 谷氨酸脱氢酶最适pH 的测定

2.4 谷氨酸脱氢酶Km值的测定

米氏常数（Km）是酶的特征性常数，Km 只与酶的种类、反应体系的pH 和反应温度有关系，而与酶的浓度和底物的浓度无关。酶的米氏常数越大，说明需要的底物浓度越高，所以酶的Km数值是反应酶性质优略的重要指标。笔者利用Lineweaver－Burk作图法对谷氨酸脱氢酶催化正反应的3个底物（NN4、α-酮戊二酸、NADH）的米氏常数（3），根据直线在横轴上的截距（1/Km），求得米氏常数Km。实验表明，麦迪卡公司产谷氨酸脱氢酶的米氏常数与进口知名品牌相比相差不大，见表1。

表1 谷氨酸脱氢酶各种底物的米氏常数（mol/L）

3 讨论

诊断试剂原料用酶属于酶制剂行业的一个小分支，与工业用酶不同，生化诊断试剂用原料酶理化性质要求较高。一种好的诊断试剂原料酶应当具有条件是热稳定性好、pH 稳定范围宽，Km 数值较低。目前，国内对诊断原料用酶研究较少，对新的诊断用原料用酶的酶学性质研究更是相对滞后。所以对国产诊断用原料酶的酶学性质进行研究对正确使用酶法诊断试剂有指导意义。

该研究对麦迪卡公司生产的谷氨酸脱氢酶的酸碱耐受范围、热稳定性、最适温度、最适pH 和Km 进行了测定。该种谷氨酸pH 耐受范围较宽，在pH 为5～10 范围内保持较好的稳定性；热稳定性较好，50 ℃加热20 min，酶活保留87.5%；酶动力学研究表明该种谷氨酸脱氢酶3个底物的米氏常数分别为：NN4＋是10.4×10-3mol/L；α-酮戊二酸是7.42×10-3mol/L；辅酶I（NADH）是6.65×10-4mol/L。实验结果表明，麦迪卡公司生产的谷氨酸脱氢酶酶学性质较好，适合临床诊断试剂盒使用。

[1]罗侃，崔有民.诊断用酶的研究进展[J].西北国防医学杂志，2000，21（1）：57－59.

[2]王燕，宋香，杨平平，等.谷氨酸生产菌S9114 中的谷氨酸脱氢酶的研究[J].生物工程学报，2003（19）：725-729.

[3]张克旭，刘永生.天津短杆菌T6－13 谷氨酸脱氢酶的研究[J].微生物学报，1991，31（4）：281－286.

[4]郭绍丽，张连祥，蔡忠，等.谷氨酸脱氢酶液态试剂盒的制备与临床应用[J].中国中西医结合消化杂志，2000，9（1）：46－47.

[5]郭建，姜国湖，王燕鸣.血清酶法钾、钠测定及其评价[J].中华医学检验杂志，1998（5）：32.

[6]杨艳玲.血氨检测有助于脑病、肝病的病因诊断[J].中国医刊，2006，（3）：19-22.

[7]刘兰英，刘宝琦，曹亚光，等.谷氨酸脱氢酶（GDH）的性质[J].吉林大学自然科学学报，1993（3）：119-121.