恩施续断中含硒化合物体外抗氧化活性分析

王应玲，李艳君，张 驰*

(1．湖北省地质局 第二地质大队，湖北 恩施445000;2．湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施445000;3．生物资源保护与利用湖北省重点实验室( 湖北民族学院) ，湖北 恩施445000)

续断为川续断科川续断(Dipsacus asperWatl )属植物川续的根．又名川断，是该属的模式种［1］．国内外对续断已有大量的研究，主要集中在化学成分和药理作用等方面，对富硒续断中含硒化合物的抗氧化活性的研究还不多见［2］．我国72%的地区都缺硒［3］，微量元素硒缺乏会引起多种疾病，如克山病、大骨节病等，人体补充硒可以达到防癌、抗癌的作用［4－5］;而续断有很高的药用价值，含有皂苷类(20 多种)［6］、多糖类［7］、生物碱类［8］、挥发油类(40 多种)［9］等多种化合物，其提取物具有促进骨的愈合［10］、免疫调节、抗维生素E 缺乏［11］、抑制金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌等作用［12］，临床上用于腰膝酸软、肢节痿痹、跌打损伤、损筋折股、胎动漏红、血崩下血以及遗精、带下、痈疽、疮肿等症的治疗［13］．研究高硒续断具有很强的实践意义，有利于从富硒续断中提取硒蛋白和硒多糖等大分子有机硒，成为新一类补硒剂产品，为有机硒药物或保健食品的开发提供理论依据．

1 材料与方法

1．1 材料

所用材料采自湖北省恩施市的高硒续断．将续断先用自来水充分洗净后，再用双蒸水反复冲洗干净，烘干(60℃)、粉碎(40 目)并密封保存．

1．2 主要药品及试剂

牛血清白蛋白(上海蓝季科技发展有限公司);硒标准溶液(100 μg/mL)(中国计量科学研究院);考马斯亮蓝G－250 试剂;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、磷酸均为分析纯(天津市福晨化学试剂厂);无水乙醇、盐酸均为优级纯(武汉市中天化工有限责任公司);过氧化氢和硝酸分别为分析纯和优级纯(国药集团化学试剂有限公司);硼氢化钾，分析纯(西亚试剂);氢氧化钾，分析纯(天津市光复科技发展有限公司)．还有75%乙醇、无水乙醇、氯仿、异戊醇、石油醚、苯酚、草酸、氯化钠、50 mmol/L Tris－HCl 缓冲液(pH 值8．2)、2．5 mol/L PBS 缓冲液(pH 值6．6)、0．2 moL/L PBS 缓冲液(pH 值7．4)、3 mmol/L 邻苯三酚(10 mmol/L HCl 配制)、0．75 mmol/L 邻二氮菲无水乙醇溶液、0．75 mmoL/L FeSO4溶液、10%三氯乙酸(TCA)溶液、1% K3Fe(CN)6溶液、0．1% FeCl3溶液、0．015%H2O2溶液、维生素C 等，所有试剂均为分析纯，所用水为双重蒸馏水．

1．3 主要仪器设备

GZX－9140 MBE 型数显鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司);DFY－500 型500 g 摇摆式高速中药粉碎机(上海弘荃机械厂);双重蒸馏水器(SZ－93)(上海亚荣生化公司);BS 124S 型电子天平(上海天平厂);S21－3 型磁力搅拌器(上海司乐仪器厂);LXJ－ⅡB 型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂);TU－1810 型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);微波消解系统(ETHOSPLUS)(意大利MILESTONE 公司);AFS－930d 原子荧光光度计(北京海光仪器有限公司);RE－52 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器)．

1．4 方法

1．4．1 不同溶剂提取含硒蛋白质的方法及质量分数检测 参照姚敏［14］在富硒灵芝中不同种类蛋白质的提取方法，对续断中不同种类的含硒蛋白进行了提取、分离与测定．

1)水溶性含硒蛋白质的提取及检测．准确称取续断粉2 g，在磁力搅拌器上石油醚脱脂后，将沉淀用双蒸水50 mL，常温下搅拌提取4 h，5 000 r/min 离心20 min，得水提物，加(NH4)2SO4至饱和，透析，将蛋白质转出用双蒸水定容至100 mL 比色．

2)盐溶性含硒蛋白质的提取及检测．在水溶性蛋白硒提取后的残渣中加0．5 mol/L NaCl 溶液50 mL，常温下搅拌提取4 h，5 000 r/min 离心20 min，得盐提物，加(NH4)2SO4至饱和，透析，将蛋白质转出用0．5 mol/L NaCl 溶液定容至100 mL 比色．

3)醇溶性含硒蛋白质的提取检测．在盐溶性蛋白硒提取后的残渣中加75%乙醇50 mL，常温下搅拌提取4 h，5 000 r/min 离心20 min，得提取物，加1 倍量的双重蒸馏水，4℃静置过夜．4℃离心15 min(转速同上)，取沉淀，用75%乙醇定容至100 mL 比色．

4)碱溶性含硒蛋白质的提取及检测．在醇溶性蛋白硒提取后的残渣中加0．1 mol/L NaOH 溶液50 mL，常温下搅拌提取4 h，5 000 r/min 离心20 min，得提取物，将上清液中和至pH7．0，然后透析，方法同上，将蛋白质转出，0．1 mol/L NaOH 溶液定容至100 mL 比色．

1．4．2 硒多糖的提取及含量测定 准确称取续断粉2 g，在磁力搅拌器上石油醚脱脂后，加入40 mL 蒸馏水，90℃保温3 h，4℃离心15 min(转速同上)的上清液，然后用氯仿－异戊醇(24 ∶1)除去蛋白质，氯仿－异戊醇溶液与提取液体积比为1 ∶1，用分液漏斗分离出蛋白质，倒出上清液，在上清液加入1 倍量的95%的乙醇后将其放入冰箱中静置过夜，离心得到多糖沉淀，用85%乙醇洗涤3 次，再将沉淀用双蒸水溶解定容到100 mL．

1．4．3 蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量［15］．用牛血清蛋白做标准曲线，测定蛋白质量分数．

1．4．4 多糖含量的测定 采用苯酚—硫酸比色法［16］．用葡萄糖标准溶液先作标准曲线，然后测定多糖的质量分数．

1．4．5 含硒化合物清除超氧阴离子的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定清除超氧阴离子的能力，参照文献［17－18］利用邻苯三酚自氧化产生;清除超氧阴离子能力计算公式为:

式中:△D1/△t为邻苯三酚自氧化时反应速率，△D2/△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率．

1．4．6 含硒化合物清除羟自由基的方法 参照文献［19－20］并略作改进，利用Fenton 反应产生·OH．在试管中依次加入0．75 moL/L 邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL、pH 值为7．4 的PBS 缓冲液2 mL、双蒸水1 L、0．75 mmoL/L FeSO4溶液1 mL、H2O21 mL，置于37℃水浴中反应60 min，以体积比为1 ∶2 的缓冲液和双蒸水作参比液，在536 nm 波长处测其吸光度D损．按下列公式计算清除率．

式中:D样、D未、D损分别为加入样品、不加样品和H2O2体系的吸光度值．

1．4．7 含硒化合物还原力的测定 对参考文献［21－22］的方法稍加改进，在试管中加入不同体积分数的样品液2．0mL，2．5moL/L 的PBS 缓冲液2．0mL，1% K3Fe(CN)6溶液2．0mL，50℃水浴加热20min，快速冷却后，加入10%TCA 溶液2．0 mL，混匀，3 000 r/min 离心10 min，取上清液2．0 mL，依次加入双蒸水2．0 mL、0．1%FeCl3溶液0．4 mL，充分混匀，静置10 min，以双蒸水作参比，在700 nm 下测定其吸光度D，D值越大表示还原能力越强，以样品浓度对作图．

1．4．8 含硒化合物中硒含量的测定 参考文献中含硒化合物的消化方法［23］和原子荧光光度法［24］测定富硒续断各种提取物中硒含量，每个样品做两次平行．

2 结果与分析

2．1 续断中不同种类蛋白质的质量分数检测结果

考马斯亮蓝G－250 染色法测定蛋白质含量，标准曲线y=0．006 6x+0．011 5，R2=0．998 5．由此可以计算出提取的不同种类蛋白质的质量分数如图1 所示．

图1 不同溶剂提取物中蛋白质的含量的比较Fig．1 Protein content of different solvents extraction

由图1 可知:续断不同溶剂提取物中都还有一定量的蛋白质，含量多少的排列顺序依次是:碱溶性蛋白质＞水溶性蛋白质＞盐溶性蛋白质＞醇溶性蛋白质．

2．2 多糖含量测定

苯酚－硫酸法测定多糖质量分数，标准曲线y=0.007 3x－0．006 7，R2=0．999 3．由此可以计算续断样品的多糖含量为1．677 mg/g．

2．3 各种提取物中硒含量的测定结果

硒的标准溶液做得标准曲线:I= 395．228 4C+1.806 1，式中:C为测得硒的质量分数值，单位:μg/g;I为荧光度值．续断原样中硒的含量为1．538 μg/g．由此计算出续断各个样品中的含硒量．

由图2 可知:总蛋白中的含硒量大于多糖硒;四种溶剂提取蛋白质中硒含量的顺序为:醇溶性硒蛋白＞盐溶性硒蛋白＞碱溶性硒蛋白＞水溶性硒蛋白．总的来说续断中的硒主要存在蛋白质中，尤其是醇溶性蛋白含硒量最高．

图2 各种提取物中硒含量的比较Fig．2 Selenium content of different solvents extraction

2．4 不同溶剂提取物对超氧自由基的清除率的测定

邻苯三酚自氧化测定结果如图3，不同溶剂提取的蛋白质和多糖对超氧阴离子清除能力不同，续断碱提物对超氧阴离子自由基没有清除能力，其它提取物对超氧阴离子自由基的都有一定的清除能力，其中醇提物清除力最强，盐提物相对的最弱．多糖具有较强的清除超氧阴离子作用．

图3 不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除率比较Fig．3 The clearance rate of superoxide anion from different extracts

2．5 不同溶剂提取物对羟自由基的清除率的测定

Fenton 反应中吸光度值D损的测定结果如图4，续断不同溶剂提取液对羟自由基都有清除能力．按照清除能力的强弱排列其顺序为:多糖＞水提物＞盐提物＞醇提物＞碱提物．

图4 不同溶剂提取物对的羟自由基清除率比较Fig．4 The clearance rate of Hydroxyl free radicals from different extracts

2．6 不同溶剂提取物还原力测定结果

在还原能力测定反应体系中，不同溶剂提取物溶液可以提供电子，使Fe3+还原成Fe2+，并与自由基形成较稳定的物质，中断自氧化连锁反应引起体系吸光度增加，表现出抗氧化作用潜力．所得提取物的还原能力比较如图5 所示．由图5 可知，还原能力大小表现为:碱提物＞水提物＞盐提物＞多糖＞醇提物．

3 结论与讨论

本文分别提取了续断中四种溶剂硒蛋白、总可溶性蛋白及硒多糖，并测定了以上各种提取物的含量，及各组分中硒的含量，除此之外本文还测定了各提取物清除超氧阴离子自由基、清除羟自由基的能力，以及它们各自的还原力．分析结果得知:四种溶剂提取物中均含有一定量的硒蛋白，其含量相对来说也比较平均，总可溶性蛋白质的含量达到1．314 mg/g，蛋白质含量最低的是醇溶性蛋白，含量为0．258 mg/g，四种可溶性蛋白质含量排列顺序为:碱溶性蛋白质＞水溶性蛋白质＞盐溶性蛋白质＞醇溶性蛋白质．续断中多糖的含量为1．677 mg/g，比总可溶蛋白含量高．续断中硒的含量为1.538 μg/g，蛋白质、多糖中都赋存一定量的硒，蛋白硒是续断中硒的主要赋存形态．四种溶剂提取物中醇溶性硒蛋白的含量最高，它的含量可达总可溶性蛋白的42.76%．按照相同质量样品中结合硒量得多少，可以得出含硒量多少的顺序为:总蛋白硒＞多糖结合硒;醇溶性硒蛋白＞盐溶性硒蛋白＞碱溶性硒蛋白＞水溶性硒蛋白．

恩施续断中各种提取物都有一定的清除超氧阴离子和羟自由基的能力，且不同溶剂提取物的清除率都不同，其中醇溶性提取物的清除率超氧自由基的能力最好，达到了22．642%，碱溶性提取物清除超氧自由基的能力最弱;硒多糖清除羟自由基的能力最强，清除率为85．42%．续断不同提取物都具有一定的还原力，还原力的强弱顺序为:碱提物＞水提物＞盐提物＞多糖＞醇提物，还原力最强的为碱溶性硒蛋白，其吸光度值达到了0．801．可见恩施续断中微量元素硒的含量相对较高，而且总的来说续断中各种提取物的清除自由基的能力较强．

研究表明，我国缺硒地方还很多，因缺硒引起的疾病如克山病也存在一些，研究续断中硒的赋存及含量有利于日后从续断中提取硒作为缺硒人群的硒补充剂，硒对预防心血管疾病也有重要作用，有利于维持心血管系统正常的结构与功能，预防动脉硬化与冠心病的出现，能维持机体的正常血压．硒的生这些理作用也可用于保健品，有助于人们的健康．硒的抗衰老作用也日益受到人们的重视，这一作用可以将硒应用到美容产品中，起到一定的抗皱抗衰老的作用．目前越来越多的研究表明大量的自由基存在危害人们的健康，它是多种疾病的诱因，因此清除自由基刻不容缓，在众多的合成抗氧化剂在市场上流通的情况下，人们越来越重视安全、科学养生，从续断中提取天然抗氧化剂将会是一种更加绿色、安全的方法．可见本研究是具有实际意义的，它为人们的健康有很大的帮助，今后能够应用于生产还需要更进一步的研究，希望今后有更多的人能够在这个领域上做更进一步的研究．

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