NF-κB抑制剂PDTC保护全脑缺血/再灌注大鼠海马损伤机制涉及COX2-PGI2/TXA2通路的初探

王 佳，杨俊卿，余丽娟，杨 彬，赵 磊，蒋青松

(重庆医科大学药理学教研室，重庆医科大学生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016)

缺血性脑血管疾病的死亡率高达30%，是全球导致成年人永久性残疾和死亡的主要原因之一［1］。缺血性脑血管疾病包括全脑缺血和局灶性脑缺血。局灶性脑缺血多为脑栓塞引起，而全脑缺血常见于呼吸心跳骤停、药物中毒、窒息、休克以及外科手术中存在的低压低氧状况。血液灌流恢复后脑缺血损伤进一步加重，即存在“脑缺血/再灌注损伤”。近10年累积的大量研究资料显示，脑缺血/再灌注损伤中炎症的发展是引发迟发性神经元死亡的重要因素［2－3］。炎症过程产生的自由基一方面可以导致自由基损伤，另一方面可与炎性细胞因子一起激活炎症反应，形成炎症反应的恶性循环。因此通过高位阻断炎症通路的级联放大可能对减轻神经元损伤有利。核转录因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可通过启动多种炎性基因的转录参与缺血性脑损伤。已有研究证实NF-κB的抑制剂吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐 (pyrrolidine dithiocarbamic，PDTC)可以清除活性氧;另一方面，NF-κB为环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX2)的上游调节靶点，COX2基因启动子序列中有2个 NF-κB位点，PDTC可通过抑制 NF-κB而降低 COX2、TNF-α、IL-1β 等的水平，从而产生局灶性脑缺血损伤保护作用［4］。COX2为花生四烯酸代谢生成前列环素(prostacyclin，PGI2)和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)过程中的关键酶。脑缺血/再灌注后NF-κB和COX2蛋白的高表达可能与海马神经元的迟发损伤有关［5］。PGI2/TXA2比例的失调可促进血小板凝集、微循环障碍，从而加重缺血/再灌注脑损伤［6］，非甾体抗炎药对局灶脑缺血/再灌注损伤的保护作用与降低PGI2/TXA2比值有关 。但是，目前尚未见从COX2-PGI2/TXA2通路来探讨PDTC对局灶脑缺血/再灌注损伤保护作用机制的报道;另一方面，由于全脑缺血与局灶脑缺血代表的临床疾病是不同的，其损伤机制也可能不完全相同，更未见PDTC对全脑缺血/再灌注脑损伤的作用及其机制报道。因此本研究拟通过建立全脑缺血/再灌注大鼠脑损伤模型，观察PDTC对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的影响，并从COX2-PGI2/TXA2通路的改变初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 ♂ SD大鼠，SPF级，200 g～250 g，购自重庆医科大学实验动物中心［动物证书号:SCXK(渝)2010－0001］。SPF环境饲养3 d。术前12 h禁食，自由饮水。实验动物随机分为4组，即假手术组、全脑缺血/再灌注组(GCIR组)、PDTC 100 mg·kg－1组(P100组)、PDTC 200 mg·kg－1组(P200组)。每组12 只大鼠。

1.1.2 试剂 PDTC(碧云天生物技术研究所，S1808)、兔抗 COX-2 多克隆抗体(Santa cruz，SC-1745)、6-keto-PGF1α检测ELISA试剂盒(Cayman 公司，515211)、TXB2检测ELISA试剂盒(Cayman公司，519031)。

1.1.3 主要仪器 激光多普勒血流仪(Moor公司;VMS-LDF1型)，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 脑血流的测定 大鼠以水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉，剪开头部皮肤，暴露前囟和顶骨，在前囟向右旁开3 mm，向后下移3 mm处将激光多普勒血流仪的探头固定于顶骨上，进行全脑缺血/再灌注手术。激光多普勒血流仪记录大鼠手术过程中的脑血流变化，缺血操作时脑血流值下降到其正常血流值40%以下为选入标准。

1.2.2 模型的建立 参照文献［6，8］的方法，将水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉的大鼠仰卧固定，颈正中切口。分离双侧颈总动脉与一侧颈总静脉。由颈总静脉插管入心房，输入肝素化生理盐水。缓慢抽取每只大鼠总血容量体积分数0.3的血液(大鼠体重不同而血容量也不同)，双侧颈总动脉夹闭20 min后松开动脉夹，然后缓慢回输血液，结扎颈总静脉，缝合伤口。假手术组除不进行抽血与夹闭双侧颈总动脉，其余手术操作同GCIR。手术过程中，大鼠体温保持在(36.5～37.2)℃。

1.2.3 大鼠空间学习记忆能力测试 水迷宫测试分为两个阶段，第1次训练时将大鼠置于平台上1 min。后将大鼠分别从A、B、C、D 4个象限背对平台入水，让其自由游泳找到隐蔽于水中的平台，观察记录其寻台潜伏期，180 s内未找到平台者将其寻台潜伏期记为180 s。训练4 d，每天4次。第2阶段为测试阶段，第5天时，撤去平台，从A，B，C，D 4个象限随机选定一个位置将大鼠放入水迷宫中，观察并记录大鼠寻台潜伏期作为大鼠记忆成绩。

1.2.4 组织病理学检查 大鼠以水合氯醛(400 mg·kg－1，ip)麻醉，仰卧位固定。剪开胸腔，剥离心包，头皮针经心尖刺入左心室，灌注肝素化生理盐水，以肝脏作为血液与灌注液出口。注入4%多聚甲醛的磷酸缓冲液进行在体脑组织固定。分离脑组织，4%多聚甲醛固定3 d，脑组织冠状面切片，切片厚约5 μm，HE染色观察海马神经元形态及数目变化。于10×40视野下随机选取相应区域10个不重叠视野进行神经元细胞计数。

1.2.5 Western blot测定大鼠海马COX2蛋白表达提取大鼠海马蛋白，加入上样缓冲液煮沸变性。SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，室温封闭1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入 COX2抗体(1∶100)或β-actin(1∶1 000)，4℃过夜，TBST洗膜10 min×3次，辣根酶标记的二抗 (1∶2 000)室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化学发光。以COX2与β-actin的光密度值比值作为COX2蛋白的相对量。

1.2.6 ELISA 测定大鼠海马 6-keto-PGF1α和 TXB2含量 PGI2和TXA2体内迅速被代谢为6-keto-PGF1α和 TXB2，因而测定 6-keto-PGF1α和 TXB2含量。用EIA Buffer将海马制成10 g·L－1的匀浆液，具体操作按Cayman说明书进行。酶标仪上于405 nm波长处测定吸光度值。

2 结果

2.1 模型大鼠手术中脑血流变化 夹闭双侧颈总动脉前，脑血流灌注量均值为(71.36±4.58)PU，缺血时降为 (19.18±4.47)PU，降幅达到73.12%。夹闭完成后，血流迅速恢复，均值为(78.18±8.06)PU，Fig 1为原始记录图。

2.2 PDTC对全脑缺血/再灌注大鼠空间学习记忆能力的影响 水迷宫检测发现，与假手术组相比，训练阶段与测试阶段中，GCIR组大鼠寻台潜伏期均明显延长(P＜0.05)。P100组和P200组大鼠寻台潜伏期较GCIR组大鼠明显缩短(Tab 1)。

Tab 1 Effects of PDTC on changes of spatial learning and memory function in global cerebral ischemia reperfusion rats(x±s，n=12)

Fig 1 Dynamic changes of rat cerebral blood flow during GCIR

2.3 大鼠海马组织病理形态学变化 假手术组大鼠海马神经元结构清楚完整，细胞排列层次分明。而GCIR大鼠海马神经元出现明显的核固缩，细胞层次及数目明显减少，PDTC预处理组大鼠海马神经元核固缩细胞数目明显少于GCIR组(Fig 2)。P100组和P200组大鼠海马神经元死亡率较GCIR组明显减少，但与假手术组差异仍有显著性，P100组和P200组间变化无统计学意义(Fig 3)。

Fig 2 Pathological changes in hippocampus CA1 subfield of rats(×400)

Fig 3Effect of PDTC on decrease of cell death(±s，n=4)

2.4 PDTC对全脑缺血/再灌注大鼠海马COX2蛋白表达的影响 与假手术组比较，GCIR组大鼠海马COX2蛋白表达明显增加;与GCIR组比较，P100组和P200组大鼠海马COX2蛋白表达明显降低，P100组和P200组间则无差异(Fig 4)。

Fig 4Expression of COX2 protein in rat hippocampus(±s，n=4)

2.5 PDTC对全脑缺血/再灌注大鼠海马6-keto-PGF1α/TXB2的影响 与假手术组比较，GCIR组大鼠海马 6-keto-PGF1α、TXB2、6-keto-PGF1α/TXB2比值明显升高。与GCIR组相比，P100组和P200组6-keto-PGF1α、TXB2、6-keto-PGF1α/TXB2比值明显降低(Tab 2)。

Tab 2 Effects of PDTC on levels of 6-keto-PGF1α，TXB2 and 6-keto-PGF1α/TXB2in global cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=4)

Tab 2 Effects of PDTC on levels of 6-keto-PGF1α，TXB2 and 6-keto-PGF1α/TXB2in global cerebral ischemia reperfusion rats(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05 vs GCIR

6-keto-PGF1α/μg·g－1tissue TXB2/μg·g－1tissue P/T Sham 32.66 ±9.22 52.86 ±4.47 0.56 ±0.03 GCIR 61.15 ±12.97* 95.43 ±6.82＊＊ 0.71 ±0.06*P100 25.39 ±6.87# 47.73 ±5.77# 0.53 ±0.12#P200 26.24 ±9.62# 50.76 ±5.92# 0.51 ±0.14#

3 讨论

PDTC为NF-κB的特异性抑制剂，其通过抑制NF-κB p65亚单位或 I-κB 的降解来抑制 NF-κB 的激活。PDTC最早于1999年用于大鼠体内，且剂量高达 200 mg·kg－1时也未发现明显的毒性作用［8］。现在主要用来治疗金属中毒，且已经广泛用于心脏疾病、脑疾病、肺疾病等的研究中，因此PDTC具有广阔的临床应用前景。本研究采用100 mg·kg－1和200 mg·kg－1PDTC于全脑缺血/再灌注手术前1 h腹腔注射，观察PDTC对全脑缺血/再灌注大鼠海马损伤及COX2-PGI2/TXA2通路的影响。

本研究结果表明，PDTC预处理能明显减轻大鼠海马CA1区神经元的丢失，使核固缩细胞的数目减少，明显改善全脑缺血/再灌注损伤大鼠的空间学习记忆障碍。大量研究证实，COX2参与脑缺血后海马迟发型神经元死亡［10－11］。本研究结果显示，全脑缺血/再灌注后海马COX2蛋白表达升高，PDTC预处理组大鼠的COX2蛋白表达水平较手术组大鼠明显降低，结果提示PDTC对全脑缺血/再灌注大鼠海马神经元的保护作用可能与抑制COX2的过度表达有关。

PGI2和TXA2为花生四烯酸的代谢产物。花生四烯酸经环氧酶生成的PGH2，在PGI2合成酶作用下生成PGI2，在TXA2合成酶作用下生成TXA2。研究显示，脑缺血/再灌注后血浆及大脑皮层中PGI2/TXA2的比值降低，即PGI2合成减少，TXA2合成增多，PGI2/TXA2的比值异常导致微循环障碍［6］。与此研究不同，我们的前期研究［12］及本研究结果均发现全脑缺血/再灌注大鼠海马PGI2和TXA2均明显增高，PGI2/TXA2比值明显上升。PGI2和TXA2明显增高的机制可能是脑缺血/再灌注后自由基的产生和细胞内的钙超载激活磷脂酶A2，使膜磷脂分解产生大量花生四烯酸，COX2活性增高。与我们研究结果相似，肝脏移植缺血/再灌注损伤患者血浆中PGI2及 TXA2明显升高，PGI2/TXA2比值明显增高［13］;机械性脑损伤脑组织 PGI2及TXA2合成增加，并且 PGI2增加更显著［14］。也有研究表明［15］，大鼠海马神经元中存在前列环素合成酶，脑缺血/再灌注时前列环素合成酶的表达明显增高。这些结果提示，全脑缺血/再灌注12 d时大鼠海马 PGI2/TXA2比值明显增高是机体对脑缺血/再灌注损伤的代偿机制，其对缺血/再灌注脑损伤存在保护作用。我们的实验研究还发现，PDTC预处理组大鼠海马PGI2、TXA2水平及 PGI2/TXA2比值比缺血/再灌注大鼠明显降低，其机制可能为PDTC抑制NF-κB，高位阻断了炎症反应的恶性循环，阻止了PGI2、TXA2合成中的关键酶COX2蛋白表达的异常升高，使PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值恢复正常。

总之，PDTC预处理可减轻全脑缺血/再灌注所致的海马损伤，其机制可能涉及抑制COX2的表达，进而抑制PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值的异常增高，使PGI2、TXA2及PGI2/TXA2比值恢复至正常水平。

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