特应性皮炎患者外周血和皮损miR-155的表达及其与Th17细胞相关性研究

马蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 张俊花 运蓓蕾

特应性皮炎患者外周血和皮损miR-155的表达及其与Th17细胞相关性研究

马蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 张俊花 运蓓蕾

目的探讨特应性皮炎(AD)患者外周血与皮损组织中miR-155、Th17细胞、Th17细胞特异性转录因子RORγt及效应性细胞因子IL-17的表达及其相关性。方法用实时荧光定量RT-PCR检测37例AD患者外周血单一核细胞(PBMC)中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表达水平,流式细胞仪检测Th17细胞比例,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中IL-17的含量;并以33例性别、年龄匹配的健康儿童做对照。检测5例重度AD患者皮损与皮损周围组织中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA的表达水平,并以5例正常皮肤组织标本为对照。结果AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表达水平均明显高于健康对照(分别为5.78±1.78比1.82±0.46,6.08±1.04比1.64±0.52,7.09±1.75比1.71±0.46,均P＜0.01);AD患者PBMC中Th17细胞比例及IL-17血浆含量均明显高于健康对照,分别为(1.78±0.52)%比(0.47±0.15)%,(32.51±6.15)pg/ml比(11.80±2.24)pg/ml,均P ＜0.01。AD患者皮损、皮损周围组织及正常皮肤组织中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平间比较,差异均具有统计学意义;皮损＞皮损周围组织＞正常皮肤组织,F值分别为41.803、17.040和37.064,均P＜0.01。AD患者PBMC中miR-155 mRNA表达水平与疾病严重程度评分、Th17细胞比例、RORγt mRNA表达水平、IL-17 mRNA表达水平及IL-17血浆含量呈正相关,r值分别为0.405、0.426、0.402、0.410、0.408,均P＜0.05;皮损及皮损周围组织中miR-155 mRNA表达水平与RORγt、IL-17的mRNA表达水平呈正相关,r值分别为0.428和0.435,均P＜0.05。结论AD患者miR-155、Th17细胞及其效应性细胞因子高表达可能与AD发病有关。

皮炎,特应性;miR-155;Th17细胞

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种炎症性皮肤病,其病因及发病机制复杂。microRNA是一类内源性短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA,存在于基因组的非编码区,通过与目的基因mRNA的3'末端非翻译区(3'untranslatedregion，3'UTR)互补结合,降解目的基因mRNA和(或)抑制目的基因mRNA分子的转录后翻译,调节蛋白质生成,从而在多种自身免疫性疾病的发生、发展过程中起作用［1-2］。有学者［3］用微阵列芯片研究发现AD皮损存在44条microRNA表达失调,miR-155是明显上调的microRNA之一,提示其在AD发病中可能起一定的作用,但具体机制尚未明确。本研究通过检测AD患者外周血与皮损组织中miR-155、Th17细胞、Th17细胞特异性转录因子RORγt及其效应性细胞因子IL-17的表达水平,探讨miR-155对AD患者Th17细胞的表达调控。

对象与方法

一、对象

AD患者37例(男21例,女16例),符合Williams诊断标准［4］,平均年龄(10.14 ± 3.60)岁;健康对照为33例健康体检儿童(男18例,女15例),平均年龄(11.03±3.34)岁,两组间性别、年龄差异无统计学意义。用SCORAD评分标准判断AD疾病严重程度［5］,SCORAD评分平均值为31.89(16～51),其中中度AD(15≤SCORAD＜40)23例,重度AD(SCORAD≥40)14例。所有AD患者在入组前1周停用抗组胺药及外用糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫调节剂,6个月内未系统使用糖皮质激素及免疫相关制剂。本研究获得医院伦理委员会批准,入组者及其患儿监护人均签署知情同意书。

二、方法

1.标本采集:晨空腹采集各组受试对象外周静脉血7 ml,440×g离心分离血浆,Ficoll密度梯度离心法分离、获取外周血单一核细胞(PBMC);手术切取5例重度AD患者丘疹性损害及皮损周围组织,5例正常皮肤组织标本取自整形外科手术。标本于-70℃保存待检。

2.实时定量 RT-PCR 检测 miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表达水平:用Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)按说明书提取PBMC、皮损、皮损周围组织及正常皮肤组织中总RNA,紫外分光光度仪测定其纯度,吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之间为合格样本。分别利用miR-155茎环引物(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACCCCTAT-3')、内参U6反转录引物(5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')及oligo(dT),按M-MLV逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书合成对应的cDNA。用SYBR green real-time PCR master mix(日本Toyobo公司),分别以U6和β肌动蛋白为内参照,引物序列见表1。在Rotor-Gene 3000实时PCR仪(澳大利亚Corvett Research公司) 进行miR-155、RORγt及IL-17的定量检测。检测数据用分析软件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和双标准曲线法进行分析。

3.流式细胞仪检测外周血Th17细胞比例(CD4+IL17+T细胞/CD4+T细胞%):将PBMC在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(美国Gibco公司)中调整浓度至2×106细胞/ml,分别加入50 μg/L佛波酯(PMA)、1 mg/L钙离子载体和10 mg/L布雷菲德菌素A(BFA,均购自美国Sigma公司),37℃、5%CO2条件下共刺激培养5 h;染色方法、步骤参考说明书进行(美国eBioscience公司)。首先细胞膜FITC-CD4单克隆抗体标记,透膜、固定后PE-IL17单克隆抗体胞内染色。用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测标本,winMDI 2.9软件分析数据。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中IL-17的含量:用美国RD公司IL-17 ELISA试剂盒,按照说明书的操作标准进行。

表1 目的基因及内参基因引物序列

结 果

一、AD患者和健康对照PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平

1.目的基因(miR-155、RORγt及 IL-17)和内参基因(U6、β肌动蛋白)标准曲线直线拟合度良好,直线相关性好,可在较宽的范围内进行定量分析;扩增动力曲线呈S型,重复表现一致,扩增结果理想;熔解曲线表现为单峰,表明扩增的特异性和重复性良好。

2.AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平均显著高于健康对照者,差异具有统计学意义,见表2。

二、AD患者和健康对照者PBMC中Th17细胞比例

AD患者PBMC中Th17细胞比例(1.78±0.52%)显著高于健康对照(0.47±0.15%),差异具有统计学意义(t=14.583,P＜0.01),见图1。

三、AD患者和健康对照血浆中IL-17含量

AD患者血浆中IL-17含量为32.51±6.15 pg/ml,显著高于健康对照者(11.80±2.24 pg/ml),差异有统计学意义(t=19.102,P＜0.01)。

表2 AD患者和健康对照PBMC中miR155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平比较

图1 AD患者(1a)和健康对照者(1b)Th17细胞比例流式图

表3 AD患者皮损、皮损周围组织及正常皮肤组织中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平比较

四、AD患者皮损、皮损周围组织及正常皮肤组织中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平

AD患者皮损、皮损周围组织与正常皮肤组织间miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表达水平比较,差异具有统计学意义,P＜0.01;各组间两两比较差异亦均具有统计学意义,P＜0.05。见表3。

五、相关性检测

AD患者外周血miR-155 mRNA表达水平与SCORAD评分、Th17细胞比例、RORγt mRNA表达水平、IL-17 mRNA表达水平及IL-17血浆含量均呈正相关。SCORAD评分r=0.405,P=0.013;Th17细胞比例r=0.426,P=0.009;RORγt mRNA表达水平r=0.402,P=0.014;IL-17 mRNA表达水平r=0.410,P=0.012;血浆IL-17含量r=0.408,P=0.012。AD患者皮损及皮损周围组织中miR-155 mRNA表达水平与RORγt mRNA表达水平(r=0.428,P=0.018)及IL-17 mRNA表达水平(r=0.435,P=0.016)均呈正相关。

讨 论

Th17细胞是一组以分泌IL-17(IL-17A)为特点的CD4+T细胞亚群,其发现源于对实验性自身免疫性脑脊髓炎以及胶原诱导关节炎的研究。本研究结果显示,Th17细胞及其特异性转录因子RORγt、效应性细胞因子IL-17在AD患者外周血及皮损中均高水平表达,进一步说明Th17细胞在AD发生发展中发挥重要作用［6-7］。

miR-155是一种多功能的microRNA分子,国外学者在AD患者皮损microRNA表达谱的研究中发现,miR-155 呈明显高表达［3］。本研究结果显示,AD患者外周血、皮损及皮损周围组织miR-155 mRNA表达水平明显增高,且外周血中miR-155 mRNA表达水平与疾病严重程度评分呈正相关,表明miR-155参与AD的疾病发生过程,miR-155表达水平可能成为AD的一个新型生物标志物。miR-155已被证实能够明显影响先天性免疫和适应性免疫过程,如炎症介导、抗原提呈、T细胞分化、细胞因子产生等［8-9］。miR-155为Th17细胞分化所必需,缺失miR-155的T细胞不能正常分化为Th17细胞;miR-155基因敲除小鼠Th17细胞数量减少,且不发生EAE［8］。进一步研究表明,SOCS1(细胞因子信号抑制物1)是miR-155的直接靶基因,miR-155能够通过JAK/STAT信号途径抑制SOCS1的表达,进而促进小鼠CD4+T细胞中Th17细胞的分化与功能,RORγt及IL-17的表达均明显增加［10］。经TargetScan软件预测,SOCS1亦是人miR-155的特异性靶基因。在AD疾病状态下,miR-155是否同样能够促进Th17细胞的分化与功能尚不清楚。本研究结果表明,AD患者外周血中miR-155 mRNA表达水平与Th17细胞比例、RORγt及IL-17的mRNA表达水平、IL-17血浆含量均呈正相关,皮损及皮损周围组织中miR-155 mRNA表达水平亦与RORγt及IL-17的mRNA表达水平呈正相关,提示在AD疾病过程中高表达的miR-155可能通过促进Th17细胞的分化及其功能,增强Th17细胞的致炎作用,促发和加重皮损的炎症反应,miR-155可能成为AD治疗的一个新靶点。

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［3］Sonkoly E，Janson P，Majuri ML，et al.MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，126(3)：581-589.

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2013-05-27)

(本文编辑:吴晓初)

Expression of miR-155 in peripheral blood and skin lesions from as well as its relationship with Th17 cells in patients with atopic dermatitis

Ma Lei*，Xue Haibo，Guan Xiuhao，Shu Chunmei，Yu Juan，Zhang Junhua，Yun Beilei.*Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603，Shandong，China

Xue Haibo，Email：xuehaibo@sina.com

ObjectiveTo detect the expressions of miR-155，T helper type 17(Th17)cells，and Th17 cellspecific transcription factor RORγt and effector cytokine interleukin(IL)-17 in peripheral blood and skin lesions from，and to evaluate their relationship in，patients with atopic dermatitis(AD).MethodsPeripheral blood was obtained from 37 patients with AD and 33 age-and sex-matched healthy controls，and biopsy specimens from the lesional and perilesional skin of five patients with severe AD as well as from the normal skin of five healthy human controls.Real-time fluorescence-based reverse transcription(RT)-PCR was employed to measure the mRNA expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)and skin specimens，flow cytometry to detect the percentage of Th17 cells in PBMCs，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the plasma concentration of IL-17.Statistical analysis was done using independent sample's ttest，one-way analysis of variance followed by the least significant difference test，and linear correlation analysis.ResultsCompared with the healthy controls，the patients with AD showed a significant increase in Th17 cell percentage(1.78% ±0.52%vs.0.47% ±0.15%，P＜0.01)，mRNA expression levels of miR-155(5.78±1.78 vs.1.82±0.46，P＜0.01)，RORγt(6.08±1.04 vs.1.64±0.52，P＜0.01)and IL-17(7.09±1.75 vs.1.71±0.46，P＜0.01)，as well as in the plasma concentration of IL-17((2.51±6.15)pg/ml vs.(11.80±2.24)pg/ml，P＜0.01).There was a sequential decrease in the expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 mRNA from lesional skin，perilesional skin to normal skin(F=41.803，17.040 and 37.064 respectively，allP ＜ 0.01).The miR-155 mRNA expression level in PBMCs was positively correlated with the SCORing Atopic Dermatitis(SCORAD)index，Th17 cell percentage，RORγt and IL-17 mRNA expression levels as well as IL-17 plasma concentration(r=0.405，0.426，0.402，0.410 and 0.408 respectively，allP ＜ 0.05).Similarly，the miR-155 expression level was positively correlated with RORγt and IL-17 mRNA expression levels in lesional and paralesional specimens(r=0.428 and 0.435 respectively，bothP ＜ 0.05).ConclusionThe up-regulated expression of miR-155，Th17 cells and their effector cytokine IL-17 may be associated with the development of AD.

Dermatitis，atopic；miR-155；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.005

山东省科技发展计划(2011YD18069);山东省自然科学基金(ZR2010HQ013);山东省高等学校科技计划(J10LF90);山东省医药卫生科技发展计划(2011QZ003);滨州市科技发展计划(2011ZC0914)

256603山东,滨州医学院附属医院皮肤科(马蕾、舒春梅、于娟、张俊花)，临床学院(薛海波);中国医科大学附属第一医院(管秀好);沈阳市第七人民医院(运蓓蕾)

薛海波,Email:xuehaibo@sina.com