食品中空肠弯曲菌检测技术最新进展

胡元庆，李凤霞

(闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州363000)

弯曲菌是一种革兰氏阴性杆菌，能引起散发性和地方流行性的人类胃肠炎，特殊血清型的空肠弯曲菌对具有免疫缺陷性的人群，如癌症病人、艾滋病病人、糖尿病人、小孩和老人等，危害更加严重［1］。弯曲菌性肠炎潜伏期约为17d，主要临床症状包括发热、腹痛、水样或粘液血性腹泻以及呕吐等［2］。另外，空肠弯曲菌被认为是人类格林－巴利综合征(Guillain－Barré syndrome，GBS)最主要的前驱致病因子［1］，发病主要是由于空肠弯曲菌的菌体成分可以与宿主的神经节苷酯发生分子模拟，导致病人神经麻痹甚至瘫痪，严重威胁到人类的健康［3－5］。20世纪 90年代国内对弯曲菌检测的研究报道较少，主要由于弯曲菌病的发生较罕见，畜禽病死率低，以及弯曲菌培养条件比较苛刻等原因。近年来，弯曲菌的感染率在世界各地呈上升趋势，特别是欧美发达国家的禽肉食品污染比较严重［6］。发展中国家空肠弯曲菌污染食品的案例报道相对较少，主要是引起部分人群的腹泻及肠炎，但随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，空肠弯曲菌污染肉类食品的事件逐年增多［6］。建立空肠弯曲菌快速特异的分离检测方法，提高食品中空肠弯曲菌的检出效率，可有效控制畜产品在生产和消费中受空肠弯曲菌的污染，有助于从根本上预防控制人畜共患空肠弯曲菌病的发生。本文将综述空肠弯曲菌检测方法及技术的最新研究进展。

1 常规分离鉴定方法

空肠弯曲菌的体外培养需要较为苛刻的条件，尤其要求严格的气体环境。早在1957年King等就已发现弯曲菌与人类肠炎的发生密切相关，但直到Skirrow和Blaster使用能抑制肠道中背景菌群的培养基后，该属细菌的检出率才得以提高［7］。

弯曲菌常规分离鉴定方法包括增菌培养、选择性分离和生化鉴定。革兰氏染色、细菌动力观察、过氧化氢酶试验、氧化酶试验等可将弯曲菌鉴定到属的水平。而更精确的种特异性鉴定则需要做更多的生化试验，如硝酸盐水解试验、马尿酸盐水解试验、吲哚乙酸酯水解试验、萘啶酸和头孢菌素敏感性试验等。确定弯曲菌的属后，可使用API Campy生化鉴定试剂盒或VITEK－NH生化鉴定卡来进行种特异性鉴定［8］。近年来，还出现了 Micro－ID 系统、Enterotube系统和Mnitek系统等，从而使得空肠弯曲菌鉴定更简易化、微量化和快速化。用生化方法鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的唯一指标是马尿酸盐水解试验，其中空肠弯曲菌马尿酸盐水解试验呈阳性。也有报道显示，约10% 的空肠弯曲菌分离株在实验室培养条件下失去分解马尿酸盐的能力［9］。尽管生化方法是目前微生物学手段鉴定空肠弯曲菌的“金标准”，但实际应用中很难保证结果的准确性。

2 核酸检测方法

2.1 基因芯片

基因芯片技术广泛应用于基因序列分析、杂交、基因突变检测和多态性分析、基因组文库图型分析以及疾病的基因诊断等领域。该技术可将大量不同的探针固定于同一支持物上，一次性对同一样品进行序列监测和核酸分析［10－11］。Georgios Keramas 等［12］使用一种敏感的DNA芯片快速检测泄殖腔拭子样品中的弯曲菌。姜海等［13］利用细菌种属特异性基因、重要毒力基因以及目前已经可区分菌株亚型的基因作为靶基因探针制备基因芯片，并通过杂交反应检测常见肠道致病菌。王金玲等［14］依据 16S rRNA、23S rRNA上的恒定区和可变区设计7种致病菌的通用引物和特异性寡核苷酸探针，并对探针5'端氨基化修饰后与基因芯片共价结合，然后优化杂交反应液、芯片点样及后处理程序，研制出能同时检测动物性食品中7种主要致病菌的基因芯片。国内尤元海等［15］依据不同肠道病原菌毒力基因建立了一种基因芯片方法，可以检测大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌和肠炎耶尔森氏菌，该技术具有高效快速实用等特点，尤其适合检测腹泻病人的感染菌。基因芯片技术虽然有多方面的优越性，但在实际应用中存在检测成本高、设计要求严格等的局限性，所以不能广泛用于基层单位的检测工作。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反应体系中加上两对或两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段的PCR反应，它具有高效、系统和经济的特点，所以在多种病原微生物的同步检测和鉴定方面得到广泛应用。常选用的靶基因有16S rRNA基因、23S rRNA基因、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)、含铁细胞转运相关蛋白基因(ceuE)、细胞扩张毒素基因 cdt等［16］。Van Camp G H等［17］使用PCR的方法扩增弯曲菌的16S rRNA基因对该细菌进行鉴定。何蕊等［18］以16S rRNA、mapA和ceuE为靶基因，建立检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR方法。同时使用该方法对180份生鲜鸡肉样品进行检测，共检测出空肠弯曲菌阳性样品43份，结肠弯曲菌阳性样品12份。结果表明，多重PCR方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点，可弥补传统生化鉴定和血清学方法的不足，为弯曲菌检测提供新的技术。国内侯建军等［19］以空肠弯曲菌VS1基因的保守区设计引物，建立了能与其他食品污染菌相区别的PCR检测方法，其灵敏度达6CFU/mL，该方法具有高效、灵敏、特异和稳定的特点。

近年出现了多重PCR的改进方法，如多重PCR－变性高效液相色谱(mPCR－ HPLC)［20］。与常规mPCR－凝胶电泳检测技术不同，mPCR－HPLC经过PCR扩增后，使用DHPLC技术分辨分子大小［21］。根据分子对固定相亲和力的差异，用流动相洗脱时不同大小或者不同序列的核苷酸分子在固定相上移动速率不同检测目的片段。该技术灵敏度和特异性较高，产物分子量1%大小的片段即能够被分离检出，克服了凝胶电泳检测技术中产物条带较弱，扩增片段大小相近时，难以肉眼准确判定结果的不足。Franciosa等［22］报道了利用变性高效液相色谱鉴定肉毒杆菌神经毒素A、B、E和F型基因的研究，并指出DHPLC技术可以用于食品病原微生物的检测。曹际娟等［23］在国内首次报道了用DHPLC进行的微生物检测研究，对动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌进行高通量检测。徐君怡等［24］采用非变性DHPLC技术，建立了食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性吸收谱图，利用mPCR－DHPLC方法对弯曲菌进行快速检测的研究。PCR技术与其它相关生物检测手段联合使用，是其发挥稳定性和特异性的新方向，未来开发的重点应是适合基层检测应用的联合新技术开发和优化，使检测范围进一步扩大，检测成本保持较低水平。

2.3 套式PCR

套式PCR是用内、外两套引物进行两次PCR，第一次PCR产物作为第二次PCR的模板进行DNA扩增，该方法克服了一对引物扩增产量低而造成假阴性的缺点，大大提高了PCR扩增的灵敏度。高正琴等［25］建立了套式PCR检测空肠弯曲菌的方法，并初步应用该方法对实验动物空肠弯曲菌进行检测，最低限度为10CFU/mL，整个检测过程在8h内完成，从121份临床样品中共检出31份阳性，与传统的细菌分离方法一致。该方法与常规PCR方法相比，可从极少量模板中获得高浓度和高纯度的靶基因片段，其敏感性较常规PCR提高100倍以上。

2.4 PCR－ELISA

随着生物技术的发展，人们不再满足于PCR的定性测定，在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析，实现PCR的相对定量。但由于普通凝胶电泳检测技术本身的特异性较低，只能对样品进行粗略的相对定量。随着固相捕获技术的成熟和应用，尤其是酶联免疫吸附试验(ELISA)的成功，给核酸定量提供了一个新思路，固相捕获的PCR－ELISA技术应运而生。经PCR扩增以后，在微孔板上借用ELISA的原理，用酶标抗体进行固相杂交来实现定量［26］。Sails A D 等［27］使用 CJ2 和CC2 两个探针来检测弯曲菌。用同一对引物扩增目的基因，PCRELISA的灵敏度比以凝胶为基础的PCR高10～100倍，其灵敏度可达到1.5fg DNA。结果表明该方法具有高灵敏度、高特异性的特点，并大大降低了鉴定弯曲菌所需的时间，可用于食品和环境样品中弯曲菌的检测。

2.5 Real－time PCR

Real－time PCR即实时荧光定量PCR，是在PCR基础上建立的一项新技术，由于它具有操作简便、快速高效的特点，同时具有很高的敏感性和特异性，已被广泛应用于多个领域。Real－time PCR在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来实时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。该技术使用的荧光探针有分子信标、Taqman探针和SYBR Green I等。其中分子信标和Taqman探针法的荧光信号是特异的，检测成本也较高;而SYBR Green I法中的荧光信号是非特异的，通过荧光染料与dsDNA的结合而发出荧光，继而通过仪器自动检测出荧光信号增长曲线［28］。

Chengbo Yang等［29］建立实时定量PCR方法检测不经增菌处理的禽肉食品、牛奶和环境水样中的弯曲菌。整个反应在1h之内完成，且最低检出限为1CFU/mL。在300份禽肉样品中检出92份空肠弯曲菌阳性，300份牛奶样品中检出82份空肠弯曲菌阳性，300份环境水样中检出41份空肠弯曲菌阳性。Emma L.Best等［30］也建立了快速、特异、敏感的方法来对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行检测。Josefsen等［31］建立了一种细菌计数结合Real－time PCR检测鸡肉样品中空肠弯曲菌的技术，可在3h内检测到活的或者VBNC状态的细菌，但不能检测死亡弯曲菌的 DNA。Leblanc－Maridor M 等［32］建立了从粪便、食品和环境样品中检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的Real－time PCR方法，其灵敏度可达10个基因组拷贝，能作为研究弯曲菌流行病学的可靠技术。

3 免疫学检测方法

3.1 IMC－FPCR

免疫磁性分离技术(Immunomagnetic Separation，IMS)是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合形成抗原－抗体复合物，此复合物在磁场的作用下定向移动，从而达到分离抗原的目的。IMC－FPCR为磁珠捕获－荧光PCR，它是应用抗血清和磁性微珠制备弯曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠来捕获检样中目的菌的特定基因［33］。它具有简便快速、灵敏度高、特异性强且抗干扰能力强等特点而得到应用，该方法可望解决非可培养状态空肠弯曲菌检测的难题。Liu G等［34］针对flaA基因hipO基因设计两对引物，建立磁珠捕获－荧光PCR检测空肠弯曲菌的方法，对300份食品样品和100份水样品进行检测，在食品样品中检测出4份阳性，结果与传统的方法一致;在100份水样品中检测出1份阳性，而传统方法没有检出阳性，同时该方法也可用于VBNC(存活非可培养)状态下空肠弯曲菌的检测。David F等［35］建立磁捕获－荧光PCR对食品中的空肠弯曲菌进行检测，可检出的最少细菌数，比不用MS富集的方法低一个数量级。随着科学的发展，免疫磁珠还可以与荧光定量PCR、ELISA、流式细胞术和免疫荧光显微术等结合，实现特殊的检测目的，为弯曲菌的检测提供更加高效的手段。

3.2 ELISA

Taylor等［36］用空肠弯曲菌 NCTC11168的主要外膜蛋白制备了多价血清并建立了ELISA检测方法，这种多价血清可以和空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌三种弯曲菌反应。Griffiths等［37］利用种特异性多价血清建立了Dot－ELISA方法，可以区分空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和海鸥弯曲菌。黎诚耀等［38］以方阵滴定法确定了空肠弯曲杆菌抗血清、酶结合物的最佳工作浓度和孵育时间，从而建立了快速检测空肠弯曲菌的间接ELISA方法，对144份鸡泄殖腔粪便标本和116份猪直肠粪便标本的选择性增菌肉汤培养物进行了检测，阳性率分别为83.3%和79.3%，可于28h内报告结果。黎诚耀等［39］还应用酶标抗体染色法检测空肠弯曲菌，结果表明该方法具有较高的特异性及敏感性，在对47份鸡粪便样本和38株猪粪便样本进行检测时发现，其结果与常规细菌分离鉴定结果相同，该空肠弯曲菌的酶标抗体染色检测法可在2h内完成。

另外，许多学者研制了针对弯曲菌多种抗原的单克隆抗体，以此建立ELISA的检测方法。Monfort J D［40］建立了基于空肠弯曲菌和结肠弯曲菌鞭毛抗原单克隆抗体的ELISA方法，可以直接从泄殖腔棉拭子中检测弯曲菌。Steele［41］制备了针对空肠弯曲菌马尿酸盐水解酶的单克隆抗体，结果表明其特异性较好。Brooks［42］制备了针对LPS的单克隆抗体，特异性较好。韩文瑜等［43］应用空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体，以BA－ELISA法对鸡和猪的胴体表面、脏器及泄殖腔样本中的空肠弯曲菌进行检验，结果表明该方法具有较强的特异性和敏感性。

4 噬菌体受体蛋白捕获技术

Amit Singh等［44］建立了用噬菌体受体结合蛋白捕获空肠弯曲菌的技术，GP48RBP蛋白首先通过谷胱甘肽s－转移酶融合蛋白的方式得以表达，然后被固定到等离子表面共振器上，用其捕获待检样品中的细菌。结果表明:该技术具有较好的捕获特异性，最低检测限为102CFU/mL。后续的研究也将该技术与磁珠结合，用于捕获未被浓缩的检测样品。Muhammad A.Javed等［45］对空肠弯曲菌的噬菌体NCTC12673全基因组进行了分析，确定了GP047是结合宿主的重要受体蛋白，对该蛋白C－端四分之一氨基酸区表达(CC GP047)，然后用其在玻片上积聚弯曲菌，这个积聚过程可以再几分钟内完成，其对弯曲菌的特异性识别达到100%，其中对空肠弯曲菌的特异性为95%，对结肠弯曲菌为90%。然后对CC GP047表达为绿色荧光融合蛋白，可以通过荧光显微镜来分析被吸附的弯曲菌。

5 展望

人感染弯曲菌的主要途径是食用未煮熟的禽肉，通常为散发。弯曲菌病的爆发主要由饮用污染的水源或牛奶引起。由于空肠弯曲菌对环境的抵抗力较弱，不管是哪种途径感染，污染的样品携带空肠弯曲菌的数量都很低，给空肠弯曲菌的风险评估带来一些困难。目前，较为实用的检测方法是细菌分离培养配合PCR鉴定，检测快速且成本相对较低，但经常有漏检的情况发生。所以开发更灵敏、更特异、更快速的弯曲菌检测方法是预防该菌感染人的重要手段。近年来，随着分子生物学、免疫学、电化学的快速发展，尤其是几种学科的交叉研究，新的弯曲菌检测方法不断产生。未来对空肠弯曲菌检测方法的研究主要关注以下几个方面:为克服细菌含量低而开发的新型富集方法和前增菌方法;空肠弯曲菌新的、更特异检测抗原的发现;高通量检测方法的建立，如基因芯片方法等。

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