五味子木脂素与顺铂抑制SHG-44神经球细胞的生长

韩 磊 金 宏 孙文萍 田 晶 纪鹏艳 齐 玲 于洪泉

(吉林医药学院病理教研室，吉林 吉林 132013)

五味子是长白山的特色药材，是吉林省中药的优势产业。研究表明，五味子具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤活性部位主要是五味子木脂素和多糖〔1〕。在所有恶性肿瘤中，脑肿瘤由于位置的特殊性，给患者的生命和健康带来了极大的威胁，也使患者的生活质量明显下降。研究表明，脑肿瘤干细胞(BTSCs)是脑肿瘤发生、复发和耐药的根源〔2〕，但目前仍缺乏有效的治疗药物。本课题组研究表明，五味子木脂素可明显抑制胶质瘤细胞的生长〔3〕，顺铂是最常用的化疗药物之一，这两种药物对BTSCs的作用及机制未见报道，因此本文对其进行研究。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人脑胶质瘤SHG-44细胞株由吉林大学基础医学院提供。

1.2 药物及试剂 五味子木脂素由吉林医药学院自制，用干细胞培养液配制成浓度2 g/L备用，过滤后4℃ 保存。实验时用干细胞培养液(SCM)稀释至所需浓度。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国Sigma公司;RPMI-1640购自美国Hyclone公司，神经培养基、0.25%胰蛋白酶、小牛血清和B27添加物购自美国Gibco公司，人碱性成纤维生长因子(b FGF)和人表皮生长因子(EGF)购自英国Pepro Tech公司，bcl-2和半胱氨酸蛋白酶(caspase 3)抗体购自北京中杉公司。

1.3 细胞培养 人SHG-44细胞接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2，饱和湿度条件下进行培养，隔日换液。待细胞生长至80% ～90%，将SHG-44细胞以104/cm2密度接种到75 cm2培养瓶，加入SCM由神经培养基、B27添加物、EGF和 b FGF组成，EGF和 b FGF终浓度为20 μg/L，置于CO2培养箱中培养。每3～5 d换液一次，传代时机械吹打成单细胞悬液，按1∶2比例传代，3代以后的神经球用于实验。

1.4 细胞生长抑制实验 取对数生长期的SHG-44神经球悬于SCM中，调细胞浓度至3×105/ml，接种于96孔板，每孔100 μl，每组设5个平行孔，药物组分别加入五味子木脂素50、100、200 mg/L和顺铂10 mg/L，空白对照组加入等体积的SCM，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。分别作用24、48、72 h 取出96 孔板，加入5 μg/ml的 MTT 20 μl继续培养4 h;取出96孔板，每孔加入二甲基亚矾(DSMO)150 μl振荡20 min，使结晶完全溶解，自动酶标仪测定各孔490 nm的吸光度值(A490)。

1.5 神经球细胞分泌bcl-2和caspase 3蛋白测定 取生长状态良好的SHG-44神经球细胞，按5×104/ml密度接种于24孔培养板中，每孔1 ml。药物组分别加入五味子木脂素(50、100和200 mg/L)和顺铂10 mg/L作用72 h，每组设3个复孔，空白对照组加入SCM。取培养上清包被96孔酶标板4℃过液，封闭后加入bcl-2和caspase 3抗体(1∶500稀释)4℃过夜，次日二抗(1∶1 000稀释)室温孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色，当有颜色变化时加入终止液。自动酶标仪570 nm处测定吸光度(A)值。

1.6 统计学方法 采用SPSS11.0软件，计量资料以s表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球细胞生长的抑制作用 各浓度组五味子木脂素作用SHG-44神经球细胞24、48、72 h，均能明显地抑制神经球细胞的生长。与空白对照组比较，24 h时各浓度组，48和72 h时100、200 mg/L浓度组差异具有统计学意义(P＜0.01)，并且药物作用具有浓度依赖性。而顺铂作用SHG-44细胞后，不同时间均抑制神经球细胞的生长，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)，并且药物作用呈现时间依赖性。见表1。

2.2 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影响 不同浓度组五味子木脂素作用SHG-44神经球细胞72 h后，各用药组bcl-2蛋白分泌都呈下降趋势，100、200 mg/L浓度组与对照组相比有统计学意义(P＜0.05);各浓度组caspase 3蛋白水平升高，与对照组相比200 mg/L组有显著性差异。与对照组比较，顺铂组bcl-2水平明显下降，而caspase 3水平明显升高(P＜0.05)。见表2。

表1 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球细胞生长的抑制作用(n=5，s)

表1 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球细胞生长的抑制作用(n=5，s)

与对照组比较:1)P＜0.01

OD 值0 0.64±0.02 0.66±0.01 0.71±0.02五味子木脂素组 50 0.56±0.031)0.61±0.02 0.70±0.03 100 0.51±0.041)0.53±0.051)0.62±0.051)200 0.45±0.051)0.50±0.051)0.58±0.051)顺铂组 10 0.54±0.021)0.55±0.041)0.57±0.041)24 h 48 h 72 h对照组组别 药物浓度(mg/L)

表2 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影响(s)

表2 五味子木脂素和顺铂对SHG-44神经球分泌bcl-2和caspase 3蛋白的影响(s)

与对照组比较:1)P＜0.05

顺铂组caspase 3 0.27±0.01 0.29±0.01 0.32±0.01 0.35±0.021)0.35±0.021)指标 对照组 五味子木脂素组50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L bcl-2 0.17±0.04 0.14±0.04 0.11±0.011)0.09±0.011)0.09±0.011)

3 讨论

脑肿瘤发生部位在颅内，以胶质瘤时性居多，大多数为恶性，由于部位的隐匿性，发现即处于晚期〔4〕。同时由于脑肿瘤在人体功能中所占的特殊地位，它对生命的威胁更大，对生活质量的影响也更明显。脑肿瘤中存在的“BTSCs”是脑肿瘤发生、复发的根源，并使肿瘤对放、化疗等产生抵抗〔5〕。现有的多种化疗药物对 BTSCs治疗无效〔6〕，因此，有必要研究针对BTSCs治疗有效的药物。

对五味子的应用已有两千多年的历史，是著名的滋补中药之一，是长白山的特色中药材。因其具有抗衰老、保肝、增强机体免疫功能等多种药用功效，在《神农本草经》中五味子被列为上品。最近研究发现，五味子具有抗肿瘤作用，主要是通过氧化应激、促进凋亡等多种机制抑制肿瘤的生长，也可以调节机体免疫能力增强抗肿瘤作用〔1〕。

本实验组将人SHG-44细胞置入SCM中进行传代培养三代以上，获得具有BTSCs特性的肿瘤细胞。用不同浓度五味子木脂素和顺铂作用神经球细胞后，MTT结果显示，五味子木脂素各浓度组均可明显抑制神经球细胞的生长，并呈现剂量依赖效应。而一定浓度的顺铂在各时间段均可以抑制胶质瘤神经球细胞的生长，呈现时间依赖效应。进一步研究发现，在药物作用神经球后培养上清中bcl-2分泌水平下降，而caspase 3分泌水平升高。

细胞生长受抑制可能由于多种原因导致，但以线粒体信号传导通路中bcl-2蛋白的研究最为活跃〔7〕。bcl-2过表达可以通过阻断线粒体膜电位下降和细胞色素C的释放，降低对多种化疗药物的敏感性〔8〕，使细胞继续保持生长状态。从本实验结果可以看出，由于SHG-44神经球在五味子木脂素或顺铂作用后，引起抗凋亡因素 bcl-2蛋白表达下调，分泌减少，引起caspase 3活化，进而使细胞的生长受抑制，但更进一步的机制还有待深入研究。

1 任丽佳，李 林，殷放宙，等.五味子抗肿瘤活性成分及作用机制研究进展〔J〕.中国药理学通报，2012;28(1):140-2.

2 Qi L，Bellail AC，Rossi MR，et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis，2011;16(11):1150-64.

3 金 宏，温 娜，刘 巍，等.五味子总木脂素对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的影响.中风与神经疾病杂志，2012;28(7):613-4.

4 Holland EC.Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-4.

5 Dirks PB.Brain tumor stem cells:the cancer stem cell hypothesis writ large〔J〕.Mol Oncol，2010;4(5):420-30.

6 Eramo A，Ricci-Vitiani L，Zeuner A，et al.Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells〔J〕.Cell Death Differ，2006;13(7):1238-41.

7 李艳凤，唐丽萍，马 超，等.白附子提取物抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖及诱导凋亡的机制研究〔J〕.中国药学杂志，2009;44(16):1237-40.

8 Walczak H，Bouchon A，Stahl H，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand retains its apoptosis inducing capacity on Bcl-2 or Bcl-xL overexpressing chemotherapy-resistant tumor cells〔J〕.Cancer Res，2000;60(11):3051-7.