不同产区碎米荠nrDNA ITS序列分析及亲缘关系鉴定

向极钎+李锡香+王萌+殷红清+帅超群+朱云芬

摘要：堇叶碎米荠、壶瓶碎米荠与恩施碎米荠存在命名混乱的现象，从植株外部形态来看难以区分。为研究其亲缘关系，分别从4个有代表性的地点采集不同的居群，进行核糖体基因（nrDNA）的内转录间隔区（ITS）序列比较分析，并构建其系统发育树。结果表明，所有4份材料ITS序列全长均为709 bp，其中来自宜昌长阳和五峰的材料碱基序列完全一致，与来自恩施和壶瓶的序列相比，分别有两个碱基位点不同，4个群体的碎米荠（Cardamine hirsuta L.）可以聚为一支，居群之间的遗传距离很近，为0～0.003，这种差异未超过一个种范围内的变异，初步证明4个不同产地的碎米荠为同一个种，归为堇叶碎米荠。

关键词：碎米荠（Cardamine hirsuta L.）；核糖体nrDNA；内转录间隔区（ITS）；序列分析

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4737-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.061

nrDNA ITS Sequences Analysis and Genetic Relationship Identification of Cardamine from Different Geographical Regions

XIANG Ji-qian1，2，LI Xi-xiang3，WANG Meng1，YIN Hong-qing1，2，SHUAI Chao-qun1，2，ZHU Yun-fen1，2

（1. Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445002，Hubei，China；

2. Enshi Selenium Institute of Applied Technology and Product Development，Enshi 445002，Hubei，China；

3.Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China）

Abstract： Cardamine violifolia，Cardamine hupingshanensis and Cardamine enshiensis exist the phenomenon of confused naming. They are difficult to be distinguished from the external form of the plant. In order to study the genetic relationship of Cardamine hirsuta， different populations from four representative place were collect of. Ribosomal DNA（nrDNA） internal transcribed spacer（ITS） sequences were comparatively analyzed. The phylogenetic tree was constructed. The results showed that the full-length ITS sequences of all materials tested were 709 bp， consisted with the material base sequences from Changyang and the Wufeng. There were two base sites different from Enshi and Huping. The four groups of Cardamine hirsuta were in one cluster. The genetic distance between populations was between 0～0.003， not exceeding a range of variation. It is indicated that the Cardamine hirsuta of four different origins are the same species as the Cardamine violifolia.

Key words： Cardamine hirsuta L.； ribosomal DNA nrDNA； internal transcribed spacer （ITS）； sequence analysis

碎米荠（Cardamine hirsuta L.）[1]为十字花科碎米荠属1～2年生草本植物，生长在海拔约1 000 m的山坡林下沟边湿地，全国各地均有野生，是近年来研究较多的聚硒植物。壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis）由湖南师范大学刘林翰、刘克明发现并命名，主要分布在湖南北部的壶瓶山一带[2]。2000年湖南农业大学向天勇[3]在湖北省恩施州硒矿区鱼塘坝发现近似植物，并定名为恩施碎米荠（Cardamine enshiensis）。傅书遐[1]、彭诚等[4]将在此处发现的碎米荠鉴定为堇叶碎米荠（Cardamine violifolia），随后白宏锋等[5]将壶瓶碎米荠与近年来所报道的恩施碎米荠以及堇叶碎米荠归为同一个种，孙紫薇等[6]分析了恩施渔塘坝地区碎米荠的形态特征与核型，发现该地区碎米荠存在居群间分化，属堇叶碎米荠。王玉兵等[7]又把在湖北省五峰、长阳发现的近似植物鉴定为壶瓶碎米荠，2013年中国科学技术大学教授尹雪斌研究组将在湖北恩施发现的超富硒植物定名为壶瓶碎米荠。综上所述，恩施碎米荠、堇叶碎米荠及壶瓶碎米荠存在命名混乱的情况，其命名在世界植物学界争论激烈，且从植株外部形态来看非常接近，难以区分，均具有很高的硒富集能力。

高等植物的核糖体DNA（Ribosomal，rDNA）是由串联重复的多拷贝序列组成，每个拷贝包括编码区和内转录间隔区，编码区包括18S、5.8S和26S基因，序列高度保守，进化速率慢，常用于探讨分类学上科及以上分类单位的系统发育问题[8]；编码区之间为内转录间隔区（Internal transcribed spacer， ITS），依顺序分为第一转录间隔区（ITS1）和第二转录间隔区（ITS2）。ITS区域序列进化速率较编码区快，可以提供较丰富的变异位点和信息位点，而且稳定性好、测序方便，已成为研究植物分类和亲缘关系的有效工具和重要标记[9-12]。

本研究依据报道分别从湖北宜昌长阳崩尖子、宜昌五峰梨子坪、恩施双河鱼塘坝，湖南石门壶瓶山4个有代表性的地点采集不同的居群，进行核糖体基因（nrDNA）的内转录间隔区（ITS）序列比较分析，并构建其系统发育树，从分子生物学角度探讨恩施碎米荠、堇叶碎米荠及壶瓶碎米荠之间的亲缘关系，以期为碎米荠的分类鉴定及系统发育等研究提供理论依据，为进一步探究碎米荠超聚硒生理特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料于2013年4月分别采自不同的地点，每个种群取50株。采样地点的情况见表1。4份材料外部形态见图1。

1.2 DNA提取

分别称取4个不同产区的碎米荠幼嫩叶片100 mg，经液氮冷冻研磨，采用改良CTAB法提取DNA[13]。取2 μL DNA样品用0.8%的琼脂糖进行电泳检测。测定OD值，调整DNA浓度，分别等量混合群体的DNA。

1.3 引物设计

引物设计参照文献[9]，分别为ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由上海生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物将依次包含部分的18S编码区、ITS1、5.8S编码区、ITS2、部分28S编码区，预计大小为709 bp。

1.4 目的片段PCR扩增

ITS区扩增PCR反应体系体积为25 μL，包括模板1 μL（60 ng/μL），dNTP 2 μL（10 mmol/L），10×buffer 2.5 μL， Taq酶1μL（1 U/μL）；正反向混合引物1 μL（10 μmol/L）。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃保温5 min，4 ℃保存。反应结束后， 取2 μL反应产物1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在凝胶成像系统上观察拍照。

1.5 测序及分析

将ITS区扩增产物送生工生物工程股份有限公司纯化测序，在GenBank中搜索相近序列并下载，采用MEGA5.1软件，邻位相接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统树，模型选择Kimura-2-parameter，自展检测1 000次。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

经电泳检测，提取的碎米荠DNA质量较好，呈明亮的细线状条带（图2）。将提取的DNA稀释后测定其OD值，然后调整其浓度为30 ng/μL，分别等量混合每个群体的DNA。

2.2 PCR检测与序列比对

分别以每个群体等量混合的DNA和随机选取的单株DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其条带清晰明亮，无杂带，与理论设计长度基本吻合，PCR产物比较稳定。

经过序列的比对和校正，排除序列两端不确定的碱基，最终获得了4条序列，长度均为709 bp，4个群体的序列已登录GenBank，登录号见表1。通过MEGA5.1软件对校正后的序列进行比对，4条序列比较一致，只有个别位点不同，来自宜昌五峰和长阳的2个居群的序列完全相同（表2）。

2.3 进化树构建和遗传距离分析

以QT-1为基准，在NCBI上进行BLAST比对，分别选择下载最相似和得分最高的几条序列，搜索核糖体ITS序列下的堇叶碎米荠（一条）、壶瓶碎米荠（无）和恩施碎米荠（无），只得到了一条堇叶碎米荠的序列，对上述序列和本试验测序并校正的序列，利用MEGA5.1软件邻接法（Neighbor—Joining）构建进化树，自展检验1 000次，选用kimura-2-parameter参数模型并且计算各序列间的遗传距离，结果分别见图4和表3。结果表明，试验中4个碎米荠可以聚为一支，其遗传距离很近，为0～0.003。

3 讨论

ITS序列作为一种遗传分子标记，与形态标记、生化标记和细胞学标记等技术手段相比，具有明显的优越性。ITS区受外界环境影响较小，进化速度快，既具保守性又在科、属、种水平上具有特异性，而且序列长度适中，含有足够量的遗传信息，不但可以广泛用于物种间的鉴定，同时也被用于种内居群间的差异性分析。

试验自测的4条ITS序列可以聚为一支，亲缘关系很近，遗传距离为0～0.003，来自宜昌长阳的QT-1和五峰的QT-2碱基序列是完全一致的，与来自湖南壶瓶山的QT-3和来自湖北恩施鱼塘坝的QT-4分别有2个碱基位点的变异，通过与GenBank相近序列的比对，确定这些变异位点出现在ITS1区域。本研究中的DNA模板来自群体内的50个单株等量混合，因此这些位点的变异是可信的。自然状态下的群体遗传背景比较单一，来自宜昌、壶瓶和恩施的碎米荠可能有着共同的起源，在经历了长时间的生殖隔离和进化后形成了不同的地方种。

在序列分析中，通过搜索GenBank里与堇叶碎米荠、壶瓶碎米荠、恩施碎米荠同名的核糖体ITS序列，找到了一条堇叶碎米荠的序列，但提到序列的有机体来源是露珠碎米荠（登录号JF980320），无其他相关信息，从进化树结果看来，该序列与本试验所得的序列亲缘关系比较远，很可能不是同一物种。

综上所述，本试验比较了4个野生群体碎米荠ITS序列的差异，分析了其地理分布与ITS序列的相关性，结果表明这种差异未超过一个种范围内的变异，初步证明4个不同产地的碎米荠为同一个种，归为堇叶碎米荠。由于本研究只选取了产自湖北和湖南2个临近省份的材料进行系统发育分析，其起源中心在哪里，它们与云南等较远地区碎米荠居群间的遗传变异程度还未做鉴定分析，有待进一步探讨和研究。

参考文献：

[1] 傅书遐.湖北植物志（第2卷）[M].武汉：湖北科学技术出版社，2002.

[2] 龙跃生.碎米荠属一新种——壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanesis）的核型分析及其近缘种ITS序列进化的研究[D].长沙：湖南师范大学，2002.

[3] 向天勇.恩施碎米荠的生物学特性及叶片含硒化合物研究[D].长沙：湖南农业大学，2006.

[4] 彭 诚，丁 莉.堇叶碎米荠在恩施渔塘坝不同立地条件下的生长差异[J].安徽农业科学，2005，33（8）：1412-1431.

[5] 白宏锋，李晓明，周继业.壶瓶碎米荠种子的萌发特性研究[J].安徽农业科学，2010，38（7）：3403-3405.

[6] 孙紫薇，施 波，石开明，等.湖北省恩施高硒地区碎米荠的形态特征与核型分析[J].江苏农业科学，2010（2）：199-200.

[7] 王玉兵，陈发菊，梁宏伟.湖北省碎米荠属一新记录种——壶瓶碎米荠[J].湖北农业科学，2110，49（9）：2160-2161.

[8] 高玉梅.白菜类作物的分类与系统进化的分子研究[D].北京：中国农业科学院，2009.

[9] 黄玉吉，陈菁瑛，苏海兰，等.不同产区麦冬、山麦冬rDNA-ITS序列分析[J].福建农业学报，2009，24（6）：508-512.

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[11] FATMA P S， HIROMI Y， YAHONG G， et al.DNA authentication of plantago herb based on nucleotide sequences of 18S-28S rRNA internal transcribed spacer region[J]. Biol Pharm Bull，2007，30（7）：1265-1270.

[12] TOSHIYUKI A， NOBUKO K， MASAYUKI M. DNA sequencing analysis of ITS and 28S rRNA of Poria cocos.[J] Biol Pharm Bull， 2007， 30（8）：1472-1476.

[13] 孙志栋，王学德，倪西源，等.棉花DNA提取方法的探讨[J].浙江农业学报，16（4）：177-181.

综上所述，本试验比较了4个野生群体碎米荠ITS序列的差异，分析了其地理分布与ITS序列的相关性，结果表明这种差异未超过一个种范围内的变异，初步证明4个不同产地的碎米荠为同一个种，归为堇叶碎米荠。由于本研究只选取了产自湖北和湖南2个临近省份的材料进行系统发育分析，其起源中心在哪里，它们与云南等较远地区碎米荠居群间的遗传变异程度还未做鉴定分析，有待进一步探讨和研究。

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