刺梨中黄酮的超声提取及HPLC测定

王振伟+申森+胡晓冰

摘要：采用超声波辅助提取刺梨（Rose roxburghii Tratt.）中总黄酮，利用正交试验进行工艺优化，初步建立了刺梨中黄酮的HPLC测定方法。结果表明，超声功率、提取时间和温度均对刺梨中黄酮提取结果影响显著，确定超声辅助提取刺梨黄酮的最佳工艺条件为超声功率300 W，50%乙醇，温度40 ℃，提取时间为40 min。在此条件下，刺梨黄酮的得率为1.862%。与常规回流提取方法相比，黄酮得率有所增加，同时缩短了提取时间。HPLC法测定结果表明，刺梨中含有芦丁和槲皮素。HPLC法简便、快捷、灵敏、结果准确，可用于刺梨中黄酮成分含量的检测。

关键词：刺梨（Rose roxburghii Tratt.）；超声波；总黄酮；提取；高效液相色谱

中图分类号：S79 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4684-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.046

Extracting Total Flavonoids from Rosa roxburghii Tratt. with Ultrasonic Wave

and Determination by HPLC

WANG Zhen-wei， SHEN Sen， HU Xiao-bing

（Yellow River Conservancy Technical Institute， Kaifeng 475000，Henan， China）

Abstract：The technology of extracting total flavonoids from Rosa roxburghii Tratt with ultrasonic wave was studied. The ultrasonic wave -assisted extraction technology was optimized by orthogonal test. HPLC method in Rosa roxburghii Tratt. was established. Results showed that the effects of ultrasonic power，extraction time and temperature on extraction rate of total flavonoids were significant. The optimum conditions were the ultrasonic power of 300 W，50% ethanol， temperature of 40 ℃ and extraction time of 40 min. Under these conditions， the yield of total flavonoids was 1.862%. Compared with reflux extraction，the yield of flavonoids increased and the extraction time was shorter. It is indicated that the method was simple，accurate and sensitive and could be used in determing content of rutin and quercetin.

Key words：Rosa roxburghii Tratt.； ultrasonic wave； total flavonoids； extraction； HPLC

刺梨（Rose roxburghii Tratt.）是蔷薇科蔷薇属落叶灌木，又名缫丝花、文先果、送春归，多分布于贵州、云南等地[1]，近些年已北移河南栽植成功。刺梨营养丰富，维生素C、超氧化物歧化酶（SOD）含量高，此外还含有丰富的微量元素，具有提高免疫功能、延缓衰老、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、解毒镇静、降血脂等多种作用[2-4]。

黄酮类化合物作为刺梨的主要生物活性成分之一，具有消除自由基、抗氧化、降血糖血脂、降血压、抗肿瘤等作用。目前国内外从植物中提取总黄酮的方法很多，包括酶法、微波萃取、超临界萃取、碱性稀醇提取以及超声提取法等[5-7]。其中，超声辅助提取技术替代传统提取技术，其应用水平在不断地提升，原理是利用超声波产生的强烈振动、空化作用、粉碎作用，将植物中的活性成分提取到溶剂中去。本试验探讨超声辅助提取刺梨中的总黄酮，采用正交试验优化确定提取刺梨黄酮的最佳工艺参数，并建立了HPLC法测定刺梨提取物中芦丁和槲皮素的方法，可为促进刺梨的精深加工和综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

刺梨，购自河南开封医药大厦。

芦丁、槲皮素（标准品），中国药品生物制品检定所；甲醇，色谱纯；磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等均为分析纯。

TU-1810型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ520ODB型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HC-3018R型冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；AB204-L型电子天平（梅特勒-托利多公司），Waters 1525型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）。

1.2 方法

1.2.1 刺梨黄酮的提取 准确称取干燥、粉碎、过40目筛的刺梨粉末2.00 g，按要求加人一定量的乙醇，在不同温度、不同超声功率条件下提取一定时间，减压抽滤去渣，得到刺梨总黄酮提取液，测定提取液中黄酮含量。

1.2.2 单因素试验 分别对提取时间、温度、超声功率、乙醇体积分数进行研究，初步确定各因素的影响程度及较佳提取水平。①提取时间。在温度为60 ℃，超声功率300 W，料液比1∶20（m∶V，下同），60%乙醇的条件下提取，考察不同提取时间（20、30、40、50、60、70 min）对刺梨总黄酮提取效果的影响；②温度。超声功率300 W，料液比1∶20，60%乙醇提取40 min，考察不同温度（30、40、50、60、70、80 ℃）对刺梨总黄酮提取效果的影响；③超声功率。在温度为60 ℃，料液比1∶20，60%乙醇提取40 min，考察不同超声波功率（100、200、300、400、500 W）对刺梨总黄酮提取效果的影响；④乙醇体积分数。在温度为60 ℃，料液比1∶20，200 W超声提取40 min，考察不同乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80%）对刺梨总黄酮提取效果的影响。

1.2.3 标准曲线的绘制 准确称取干燥恒重的芦丁标准品0.025 2 g，30%的乙醇定溶于100 mL容量瓶中，摇匀备用。吸取芦丁标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加入30%的乙醇使其体积为5 mL；然后加入5%的NaNO2溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加1 mol/L的NaOH溶液4 mL，30%乙醇定容至刻度并摇匀，放置15 min。以空白为对照，于510 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为A=0.381 3C+0.006 2，R2=0.999 1。

1.2.4 黄酮提取率 取样品提取液1 mL按照“1.2.3”的方法测定其吸光度值，从回归方程中查出相应的黄酮浓度，计算刺梨总黄酮得率。

总黄酮得率=提取液总黄酮浓度×提取液体积/样品干质量×100%

1.2.5 正交试验 在前期单因素试验的基础上，选取温度、超声功率、提取时间、乙醇体积分数4个因素，采用L9（34）正交试验考察各因素对刺梨黄酮提取效果的影响，以确定超声提取刺梨黄酮的最佳工艺，并对结果进行方差分析和显著性检验。正交试验因素与水平见表1。

1.2.6 刺梨黄酮HPLC分析 利用高效液相色谱法测定刺梨提取液中芦丁、槲皮素的含量，分别精确称取0.025 0 g芦丁和槲皮素标准品，加甲醇溶解并定溶于25 mL容量瓶中，制成芦丁和槲皮素对照品混合储备液，取1 mL储备液加甲醇定容至10 mL容量瓶中得到混合对照品标准液，0.45 μm滤膜过滤备用。超声提取的刺梨黄酮原液，减压蒸发后真空干燥得到粗提物，称取0.050 0 g用甲醇溶解定容至50 mL（1 mg/mL），0.45 μm微孔滤膜过滤备用[8]。

高效液相色谱条件为：色谱柱，Waters sunfire ODS色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相，甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40），柱温30 ℃，检测波长360 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。5次重复。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间 如图1所示，提取时间在40 min内，刺梨黄酮的溶出随时间的延长而增大，超过40 min后，呈下降趋势，这可能是因为超声引起的热量集聚而导致黄酮结构发生变化而损失。超声波在较短时间内能够充分提取刺梨中的黄酮，可节约生产成本和能源消耗。因此，选择提取40 min为宜。

2.1.2 温度 如图2所示，随着温度的升高，刺梨中黄酮得率逐渐增大，当温度升高到50 ℃时，黄酮得率最高，温度再升高后黄酮得率呈下降趋势。原因可能是随着温度的升高增加了黄酮的溶解度，同时提取液黏度减小，加快了黄酮的析出。当温度过高时，可溶性蛋白质析出变性，黏度加大而影响细胞破裂，阻碍黄酮物质的析出。因此，选择温度50 ℃为宜。

2.1.3 超声功率 由图3可知，随着超声功率的增加，刺梨黄酮得率先增加，超声功率达到300 W时，黄酮得率达到最大，随后逐渐减小，可能是因为超声功率越高，超声强度越大，会增加细胞的渗透性，从而使较多的提取剂渗透进入细胞内，提取出黄酮成分，而功率过大时，黄酮物质已大量析出，收到超声波强度的作用而发生结构变化，得率降低。因此，选择超声功率300 W为宜。

2.1.4 乙醇体积分数 如图4所示，随着乙醇体积分数的增加，刺梨黄酮的得率随之升高，当乙醇体积分数达到60%时，黄酮得率达到最大。当乙醇体积分数高于60%时，黄酮得率下降，可能是某些脂溶性物质的溶出，干扰因素随之增加。因此，选择乙醇体积分数60%为宜。

2.2 正交试验结果

由表2结果可知，各种因素对刺梨中黄酮提取效果的影响主次顺序为A、C、D、B，即超声功率、温度、提取时间、乙醇体积分数。刺梨黄酮超声辅助提取最佳工艺为超声功率300 W，乙醇体积分数50%，温度40 ℃，提取时间为40 min。根据表3方差分析结果可知，超声功率、温度和提取时间3种因素对刺梨黄酮提取的影响显著，乙醇体积分数对其影响较小。

2.3 超声提取与常规回流提取效果比较

进一步对超声辅助提取与常规回流提取方法进行比较，超声辅助提取采用正交试验确定的最佳方案，常规回流采用50%的乙醇按照料液比1∶20在90 ℃回流5 h，每种方法重复5次，试验结果表明，超声提取和常规回流提取的黄酮平均得率分别为1.862%、1.034%，超声辅助提取可以大大缩短生产周期，提高产品得率。

2.4 黄酮提取液中芦丁和槲皮素HPLC检测

由图5可知，通过保留时间进行定性，芦丁标样的保留时间为2.406 min，槲皮素样品的保留时间是4.449 min，分别在2.315 min和4.633 min中出现谱峰，初步推断在刺梨果中含有芦丁和槲皮素成分。最后向样品中加入芦丁和槲皮素标样，谱峰1和2的峰高明显增高，从而确定峰1就是芦丁，峰2就是槲皮素。由此判断，刺梨样品中含有芦丁和槲皮素成分。

利用HPLC法测定芦丁和槲皮素的含量，芦丁浓度与其峰高的线性回归方程为Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系，根据外标法和实际样品的峰面积对芦丁进行定量测定，得到刺梨果中含0.702%的芦丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素线性回归方程为Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分别在1～100 μg/mL之间峰面积与进样浓度有良好的线性关系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 结论

1）正交优化试验结果表明，提取刺梨中黄酮的最佳方案为超声功率300 W，乙醇体积分数50%，温度40 ℃，提取时间为40 min。各种因素对刺梨中黄酮提取效果的影响主次顺序为超声功率、温度、提取时间、乙醇体积分数。方差分析结果表明，超声功率、温度和提取时间3种因素对黄酮的提取影响显著，乙醇体积分数对其影响较小。

2）超声辅助提取与常规回流提取方法相比，黄酮得率更高。超声辅助提取技术不仅可以解决传统提取技术发展瓶颈，而且可以大大缩短生产周期，提高产品得率。

3）采用HPLC法测定刺梨黄酮提取物，结果表明其含有芦丁和槲皮素。关于刺梨中黄酮成分的定性和定量分析还需要进一步研究，并确定刺梨中黄酮的种类和含量。

参考文献：

[1] 杜 薇，刘国文.刺梨总黄酮的含量测定及资源利用[J].食品科学，2003，24（1）：112-114.

[2] ZHANG C， LIU X， QIANG H， et al. Inhibitory effects of rosa roxburghii tratt juice on in vitro oxidative modification of low density lipoprotein and on the macrophage growth and cellular cholesteryl ester accumulation induced by oxidized low density lipoprotein[J]. Clin Chim Acta，2001，313（1-2）：37-43.

[3] 张晓玲，瞿伟蔷，孙 斌，等.刺梨总黄酮的提取纯化工艺研究[J].中成药，2005，27（9）：1089-1091.

[4] 董周永，任 辉，周亚军，等.松籽壳中总黄酮超声提取工艺响应面优化[J].食品与机械，2011，27（5）：100-102.

[5] 贾冬冬，李淑芬，杨宏玲，等.RP-HPLC法测定桑叶中芦丁和异槲皮苷含量[J].食品科学，2008，29（8）：499-501.

[6] 王振伟，胡晓冰，王 恺，等.微波辅助提取刺梨中总黄酮的工艺参数优化[J].光谱实验室，2012，29（3）：1527-1530.

[7] 王 慧，黄 聪，刘思源，等.HPLC测定刺梨中杨梅素和槲皮素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（1）：109-111.

[8] 田宏哲，周艳明，赵瑛博，等.刺梨中芦丁成分的定量测定[J].食品科学，2009，30（10）：203-205.

利用HPLC法测定芦丁和槲皮素的含量，芦丁浓度与其峰高的线性回归方程为Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系，根据外标法和实际样品的峰面积对芦丁进行定量测定，得到刺梨果中含0.702%的芦丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素线性回归方程为Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分别在1～100 μg/mL之间峰面积与进样浓度有良好的线性关系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 结论

1）正交优化试验结果表明，提取刺梨中黄酮的最佳方案为超声功率300 W，乙醇体积分数50%，温度40 ℃，提取时间为40 min。各种因素对刺梨中黄酮提取效果的影响主次顺序为超声功率、温度、提取时间、乙醇体积分数。方差分析结果表明，超声功率、温度和提取时间3种因素对黄酮的提取影响显著，乙醇体积分数对其影响较小。

2）超声辅助提取与常规回流提取方法相比，黄酮得率更高。超声辅助提取技术不仅可以解决传统提取技术发展瓶颈，而且可以大大缩短生产周期，提高产品得率。

3）采用HPLC法测定刺梨黄酮提取物，结果表明其含有芦丁和槲皮素。关于刺梨中黄酮成分的定性和定量分析还需要进一步研究，并确定刺梨中黄酮的种类和含量。

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利用HPLC法测定芦丁和槲皮素的含量，芦丁浓度与其峰高的线性回归方程为Y=15 618X-11 087，R2=0.999 1，在2～100 μg/mL范围内呈良好的线性关系，根据外标法和实际样品的峰面积对芦丁进行定量测定，得到刺梨果中含0.702%的芦丁成分（RSD=2.63%）。槲皮素线性回归方程为Y=2 063.7X-923.8（R2=0.999 2）。槲皮素分别在1～100 μg/mL之间峰面积与进样浓度有良好的线性关系，得到刺梨果中含0.12%的槲皮素成分（RSD=1.57%）。

4 结论

1）正交优化试验结果表明，提取刺梨中黄酮的最佳方案为超声功率300 W，乙醇体积分数50%，温度40 ℃，提取时间为40 min。各种因素对刺梨中黄酮提取效果的影响主次顺序为超声功率、温度、提取时间、乙醇体积分数。方差分析结果表明，超声功率、温度和提取时间3种因素对黄酮的提取影响显著，乙醇体积分数对其影响较小。

2）超声辅助提取与常规回流提取方法相比，黄酮得率更高。超声辅助提取技术不仅可以解决传统提取技术发展瓶颈，而且可以大大缩短生产周期，提高产品得率。

3）采用HPLC法测定刺梨黄酮提取物，结果表明其含有芦丁和槲皮素。关于刺梨中黄酮成分的定性和定量分析还需要进一步研究，并确定刺梨中黄酮的种类和含量。

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[6] 王振伟，胡晓冰，王 恺，等.微波辅助提取刺梨中总黄酮的工艺参数优化[J].光谱实验室，2012，29（3）：1527-1530.

[7] 王 慧，黄 聪，刘思源，等.HPLC测定刺梨中杨梅素和槲皮素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（1）：109-111.

[8] 田宏哲，周艳明，赵瑛博，等.刺梨中芦丁成分的定量测定[J].食品科学，2009，30（10）：203-205.