北虫草培养基中多糖的闪式提取工艺研究

陈丽冰+程薇+高虹+范秀芝+史德芳+吴光旭

摘要：为实现北虫草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]培养基的高效利用，采用闪式提取技术从北虫草培养基中提取多糖。通过单因素试验考察了闪式提取的液料比、提取时间、转速对提取效果的影响，利用正交试验法，优化了北虫草培养基中多糖提取的工艺。结果表明，提取时间和转速对多糖提取效果有显著影响，最佳提取工艺为液料比35∶1（mL∶g），提取时间12 min，转速8 000 r/min。在该条件下，闪式提取多糖得率为3.52%，略高于传统热水回流提取的得率，且只需在室温下进行，提取时间大大缩短，说明闪式提取是一种快速有效提取北虫草培养基中多糖的方法。

关键词：北虫草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]；多糖；闪式提取；正交试验

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4670-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.043

Flash Extraction of Polysaccharide from Cordyceps militaris（L.Fr.）Link Medium

CHEN Li-bing1，2， CHENG Wei2， GAO Hong2， FAN Xiu-zhi2，SHI De-fang2， WU Guang-xu1

（1. College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China；2. Institute of Agri-Products Processing and

Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： In order to effecntively utilize the Cordyceps militaris（L.Fr.）Link medium， flash extraction was used to extract polysaccharide from C. militaris（L.Fr.）Link medium. The effects of liquid to material ratio， extraction time and rotation rate on the extraction rate were investigated with single factor tests. The extraction conditions were optimized with orthogonal design. Results shouved that both extraction time and rotation rate had significant effects on the extraction of polysaccharide. The optimal extraction condition was： liquid to material ratio of 35∶1（mL∶g）， extracting 12 min and centrifuging at 8 000 r/min. Under the optimal conditions， the extraction rate was 3.52%， slightly higher than the traditional hot water refluxing extraction. The extraction process was carried out at room temperature， and the time was greatly reduced. It is indicated that flash extraction can be used as a rapid and effective method to extract polysaccharide from C. militaris（L.Fr.）Link medium.

Key words： Cordyceps militaris（L.Fr.）Link； polysaccharide； flash extraction； orthogonal test

北虫草[Cordyceps militaris（L.Fr.）Link]，又名北冬虫夏草、蛹虫草[1]，属于真菌门（Eumycota）虫草属（Cordyceps）[2]。北虫草与中药冬虫夏草有相似的药理活性，虫草多糖是其最重要的有效成分之一，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤、增强免疫等多种活性，且对机体无毒性[3-6]。近年来，研究者尝试用大米、小麦等作为培养基来人工培育北虫草子实体，为北虫草有效成分的研究与应用提供原料，但子实体采收后，长满菌丝体的固体培养残基的利用却鲜有报道[7]。研究表明，北虫草固体培养残基中虫草素的含量约为5‰，总糖含量为21.93%，蛋白质仍达10%左右（比培养前高2.1%），虫草多糖含量为12.86%，还含有生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、维生素等有效成分[8]。因此，从北虫草残留培养基中提取虫草多糖，具有广泛的应用前景。

目前多糖提取常用的方法有热水浸提[9]、超声提取[10]和微波辅助提取[11]等。热水浸提操作简便，是常见的使用方法，但该方法提取时间长、提取率低，长时间高温还可能引起多糖的分解、氧化[12]。超声波法提取时间短、提取率高，但当超声功率过大时，也会导致分子的裂解，进而降低得率；微波法可将提取时间缩短到10 min以内，同时由于微波的极性选择性，在多糖得率增加的基础上，使其纯度也有所提高[13]。但微波的穿透深度不够，在设备工艺放大后，其效能急剧下降，而且还面临微波泄漏的问题，因此工业化应用不广泛。闪式提取法是一种提取天然产物的新技术，该方法是在室温和适当溶剂条件下，利用高速剪切力和搅拌力将植物原料粉碎至细微颗粒，并在局部负压渗透作用下使有效成分迅速分散达到溶解平衡[14]。与传统浸提方法相比，闪式提取法具有快速、高效、完全、节能等优点[15]。目前，该方法已开始在植物有效成分提取中应用[16-18]，但将其应用于虫草多糖的提取未见报道。本研究采用闪式提取法对北虫草培养基中的虫草多糖进行了提取试验，在单因素试验的基础上，通过正交试验获得最佳提取工艺，以期为北虫草培养基中多糖提取的深入研究和开发利用提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北虫草培养基：由阳新新冠生态农业开发有限公司提供，培养基以大米为主；α-淀粉酶（酶活为3 700 U/g），北京奥博星生物技术有限责任公司；98%浓硫酸、苯酚、葡萄糖、95%乙醇、无水乙醇等，国药集团，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JHBE-50T型闪式提取器，河南金鼐科技发展有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；LXJ-IIB型离心机，上海安亭科学仪器厂；TYSP-200型高速万能粉碎机，浙江省永康市红太阳机电有限公司；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HJ-6A型多头磁力加热搅拌器，常州国华电器有限公司；CS101-1E型电热恒温鼓风干燥箱，重庆四达试验设备有限公司；JA2003B型电子天平，上海越平科学仪器有限公司；XH-C型漩涡振荡器，常州市国立试验设备研究所。

1.3 方法

1.3.1 绘制标准曲线 按照NY/T 1676—2008的方法测定[19]，略有改动。

精确称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.100 0 g于100 mL烧杯中，用去离子水溶解并定容至1 000 mL，此时标准葡萄糖工作液终浓度为0.1 g/L，置于4 ℃冰箱贮存。分别精确吸取葡萄糖液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于20 mL具塞试管中，用去离子水补至1.0 mL。试液中加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，然后快速加入5 mL浓硫酸，静置10 min。使用漩涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30 ℃水浴中反应20 min，采用紫外分光光度计于波长490 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 多糖的测定 将北虫草培养基置于电热恒温干燥箱，60 ℃烘干至恒重后粉碎过20 mm孔径筛。采用苯酚硫酸法测定多糖得率。精确称取样品50 mg，用去离子水溶解并定容至100 mL，摇匀。精确吸取0.2 mL样液，加入0.8 mL蒸馏水，后续步骤同“1.3.1”，同时做空白，每组平行做3组。多糖浓度按照回归方程进行计算。多糖得率计算公式如下：

X1=■×100%

式中：X1为虫草培养基多糖得率（%）；C为所得虫草多糖质量浓度（mg/mL）；V为虫草多糖样品液体积（mL）；M为烘干后培养基粉末取样量（g）；N为稀释倍数；m1为虫草多糖烘干质量（g）；m0为烘干后虫草粗多糖取样量（mg）。

1.3.3 热水回流提取虫草培养基中多糖 分别取25 g虫草培养基粉末于2个圆底烧瓶中，料液比1∶30（g∶mL），90 ℃回流3 h，4 000 r/min离心10 min，上清液置于烧杯中，残渣进行以上操作得上清液，合并上清液，旋蒸浓缩到一定体积，其中一个样品直接加入5倍体积的95%乙醇，于4 ℃冰箱中静置过夜。另一个按以下条件先将淀粉酶解（相关参数经预试验优化）：0.5 g α-淀粉酶，60 ℃，pH 为6，时间为3 h。酶解后再加入5倍体积的95%乙醇，于4 ℃冰箱中静置过夜。次日取出醇析液4 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用适量无水乙醇洗涤，后放入60 ℃烘箱中烘干至恒重。将烘干的样品称量，取其中0.05 g用蒸馏水溶解并定容至100 mL。按照“1.3.2”的方法在490 nm处测定吸光度值，同时做空白，每组平行做3组，计算北虫草培养基中多糖含量。

1.3.4 单因素试验

1）液料比对提取北虫草培养基中多糖得率的影响。分别称取25 g烘干的虫草培养基粉末，在不同液料比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g，下同）条件下，于闪式提取器中，以相同转速8 000 r/min提取8 min，离心后对残渣再重复操作一次，合并上清液，然后将提取液用旋转蒸发仪浓缩至约100 mL，加入0.5 g α-淀粉酶，在pH 6，60 ℃下磁力搅拌酶解3 h，最后加入5倍体积的95%乙醇醇沉，静置过夜。次日再离心，用无水乙醇洗涤沉淀两次，放入烘箱中60 ℃烘干至恒重得虫草粗多糖，用苯酚硫酸法测定多糖含量，计算多糖得率。

2）提取时间对提取北虫草培养基中多糖得率的影响。分别称取25 g烘干的虫草培养基粉末，在液料比20∶1、转速8 000 r/min的条件下分别提取4、6、8、10、12、14 min，步骤同上，计算多糖得率。

3）转速对提取北虫草培养基中多糖得率的影响。分别称取25 g烘干的虫草培养基粉末，以不同的转速4 000、6 000、8 000、10 000 r/min，于闪式提取器中在液料比20∶1下提取8 min，步骤同上，计算多糖得率。

1.3.5 正交试验 以虫草多糖得率为指标，根据单因素试验结果，利用正交试验对工艺参数进行优化。考察各因素对提取北虫草培养基中多糖得率的影响，确定考察的因素为液料比、提取时间、转速。每因素选取3个水平，按照L9（34）正交试验进行设计，各因素与水平如表1所示。

试验数据用极差法和方差分析法进行分析，以确定北虫草培养基中多糖闪式提取的最佳参数条件。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖溶液的标准曲线

绘制葡萄糖溶液的标准曲线如图1所示，得到其回归方程Y=13.465X+0.006（R2=0.999 6），标准曲线线性关系良好。

2.2 热水回流提取虫草多糖结果

从表2可知，北虫草大米培养基提取液中不添加α-淀粉酶和添加α-淀粉酶时，前者所得虫草多糖得率是后者的2.42倍，可能是北虫草培养基中还残存大量的淀粉，若不添加α-淀粉酶去除样品中的淀粉将造成多糖得率虚高，使得到的结果不准确。根据预试验优化淀粉的最佳酶解工艺，在此条件下，基本排除了虫草多糖测定中淀粉的干扰，使得试验结果更加准确可信。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 液料比对北虫草培养基中多糖提取的影响 由图2可知，随着液料比的变大，传质推动力不断提高，促进了活性成分在水中的溶解和扩散，从而提高了活性成分的得率[20]，即多糖得率随之增加。液料比在20∶1～30∶1时，多糖得率增大的幅度较快；当液料比大于30∶1时，多糖得率呈下降趋势。这是由于溶剂用量的增加可以提高北虫草培养基粉末与提取溶剂的接触面积，增大固液浓度差，有利于扩散速度的提高[21]，但当液料比达到一定程度时，传质推动力不再提高，因此，继续增加液料比，固液浓度差增幅不太明显，从而多糖得率增速变缓，过多的提取溶剂反而会使多糖得率降低。因此，选择提取的液料比为30∶1。

2.3.2 提取时间对北虫草培养基中多糖提取的影响 由图3可知，在闪式提取12 min内，北虫草培养基中多糖得率随时间的增加明显升高，在12 min 时多糖得率达到最大值，随着作用时间的延长，多糖得率有所降低。这可能是在闪提过程中由于刀头剪切力的长时间作用，使培养基组织充分粉碎，产生过细的粉末使滤饼层致密，影响了多糖的滤出，使多糖提取效果降低。因此，选择提取时间为12 min。

2.3.3 转速对北虫草培养基中多糖提取的影响 由图4可知，当电机转速从4 000 r/min增加到6 000 r/min的过程中，北虫草培养基中多糖得率随着转速的提高而增加，这是因为闪式提取器的转数越高，越有利于培养基的粉碎、细胞组织的破坏和溶质向溶剂的扩散，从而促进溶质的浸出和溶解[22]。当转速达到6 000 r/min时多糖得率达到最大值，而随后增加转速，多糖得率反而降低。这可能是因为闪式提取器的电机转速加快，造成溶液剧烈翻滚，溶液局部温度过高，多糖的结构发生变化或遭到破坏，从而使多糖提取效果降低。因此，选择闪提的转速为6 000 r/min。

2.4 正交试验

正交试验和方差分析结果见表3、表4。从表3可知，影响北虫草培养基中多糖得率的各因素的主次顺序为C、B、A，即转速影响最大，其次是提取时间，影响最小的是液料比。方差分析结果（表4）表明，闪式提取的提取时间和转速对北虫草培养基中多糖的提取具有显著影响（P<0.05）。在试验设计范围内，得到闪式提取北虫草培养基中多糖的优化工艺条件为A3B2C3。

2.5 验证试验

按照优化工艺条件进行3次平行试验，得到多糖得率平均值为3.52%，高于单因素试验和正交试验的结果，故确定北虫草培养基中多糖提取的最佳工艺条件为液料比35∶1，提取时间12 min，转速8 000 r/min。在此条件下，对闪式提取与传统热水回流的效果进行了比较（表5）。由表5可知，闪式提取多糖的得率略高于热水回流提取，但与热水回流提取相比，闪式提取只需在室温（25 ℃）下进行，有效避免了长时间高温提取对多糖结构的破坏，且提取时间由180 min缩短为12 min，节省了能耗，提高了效率。

3 小结

本研究将闪式提取法应用于北虫草培养基中多糖的提取，试验发现提取时间和转速对北虫草培养基中多糖提取具有显著影响，通过正交试验得到最佳提取工艺为液料比35∶1，提取时间12 min，转速8 000 r/min，多糖得率为3.52%。由于本试验所用虫草培养基原料为大米，所以培养基中残存的大量淀粉会干扰虫草多糖的测定，因此试验中添加α-淀粉酶以去除淀粉，排除干扰，使所得结果更为准确。与传统提取方法相比，闪式提取具有快速、高效、简单、节能的特点。

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