原代猪成纤维细胞电转染条件的探索

刘西梅+华再东+张立苹+肖红卫+李莉+任红艳+毕延震

摘要：用绿色荧光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）作为目的基因，对原代猪成纤维细胞电转染条件进行探索。结果表明，在电压1 200 V/cm、脉冲时间3 ms、pEGFP-N1添加量4 mg/mL时电转染效率最好。

关键词：猪；绿色荧光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）；原代成纤维细胞；电转染

中图分类号：S813.3；S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4647-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.037

Electroporation Parameters of Primary Swine Fibroblasts

LIU Xi-mei， HUA Zai-dong， ZHANG Li-ping， XIAO Hong-wei， LI Li， REN Hong-yan， BI Yan-zhen

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Hubei Academy of Agricultural Science， Hubei Key Lab of Animal Embryo

and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： The electroporation conditions of primary porcine fibroblasts were studied using the EGFP-N1 genes as target gene. The results showed that the transfection efficiency was the best when 4 mg/mL pEGFP-N1 was added and it was pulsed 3 ms under 1 200 V/cm voltage.

Key words：swine； pEGFP-N1； primary fibroblast； electroporation

开展转基因克隆猪研究不仅对畜牧业具有重大的推动作用，而且能为人类医学和生物学研究提供理想的动物模型，其研究和应用的第一关就是体细胞的转基因。细胞转基因的方法很多，如病毒载体法、显微注射法、微粒子轰击法、磷酸钙共沉淀法、脂质体法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法（也称电击法、电转染）等，在这些方法中，以操作简单、毒性低、效率高等特点而被普遍采用的方法之一当属电穿孔法[1，2]。该方法是20世纪80年代初期发展起来的，主要用于将DNA导入多种传代细胞，理论上可以转染几乎所有类型不同状态的细胞，而原代细胞的转染是近年发展起来的[3，4]。对原代细胞转基因能有效地降低转基因细胞代次，从而提高体细胞克隆的效率，这对于克隆转基因猪显得尤为重要。猪胎儿成纤维细胞是转基因克隆猪生产中的常用细胞系，目前普遍存在转染效率低下的问题，只能通过长期药物筛选来富集阳性细胞，而长期药物筛选往往会影响细胞生理特性，增加细胞的传递次数，对后续试验产生不利影响，因而迫切需要一种高效的转染方法[5]。本试验采用原代猪成纤维细胞探索不同的电转染条件，筛选出最为优化的方案，以提高原代细胞的转染效率，从而间接提高了转基因克隆猪的总效率。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及仪器

绿色荧光蛋白基因的DNA（pEGFP-N1）质粒为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所生物技术实验室保存；双抗（10万 U/mL青霉素和100万 U/mL链霉素）、FBS（胎牛血清）、DMEM培养基（杜尔贝科改良Eagles 培养基）、PBS（杜尔贝科磷酸缓冲液）、胰蛋白酶、质粒提取试剂盒均购自Gibco公司；电穿孔液购自Eppendorf公司。

电穿孔仪BTX2000及电穿孔杯购自BTX公司，荧光显微镜为Leica。

1.2 转染质粒pEGFP—N1的提取

将pEGFP-N1质粒转化入大肠杆菌DH 5α，挑取单克隆细菌于灭菌 LB培养液培养扩增，用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒提取质粒pEGFP-N1，测定其浓度后，-20 ℃保存，电转染备用。

1.3 猪胎儿成纤维细胞培养

无菌条件下取35日龄胎猪（湖北白猪），用含双抗的PBS冲洗2～3次，取上皮组织，以含双抗的PBS清洗1次，再用含双抗的DMEM培养基清洗1次，剪成小于1 mm3的组织块，将组织一块块种植在6孔的细胞板内，4 h后每孔加1.8 mL DMEM培养基和0.2 mL FBS再放入培养箱，39 ℃、0.5%CO2、饱和湿度环境下培养。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况，3～4 d换一次培养基[5]。待细胞生长到80%左右消化后用于电转染。

1.4 电转染细胞制备

细胞生长到80%左右后，去除培养基，先用PBS液清洗1～2次，再用0.25%胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，待细胞间隙出现时去除胰酶，加含10%FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻吹打悬浮细胞，离心，再用PBS液洗涤，离心后沉淀细胞加电穿孔液，稀释调整细胞密度为1×105 Ce//s/mL[2，6]，取100 μL于2 mm电转染杯中在不同条件参数下进行电转染。于24 h和48 h在倒置荧光显微镜下观察。

1.5 荧光显微镜下观察 pEGFP—N1的表达

在倒置荧光显微镜下观察时，根据荧光强度和荧光细胞的比例计数。同一个视野先计数在蓝光激发下发出绿色荧光的细胞，然后于可见光下计数该视野的细胞总数。电转染率=发出绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。每孔随机统计6个视野[2]。

1.6 试验设计

1）不同电压对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定电脉冲时间为3 ms，分别在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4个电压条件下电转染，再分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以探索最佳电压参数。

2）不同脉冲时间对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V，在2、3、4、5 ms 4个脉冲时间进行电转染，分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的脉冲时间。

3）不同浓度的pEGFP-N1对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中分别按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V， 电脉冲时间为3 ms进行电转染，再分别于电转染后的24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的pEGFP-N1浓度。

以上每种试验均重复3次，结果取平均值。试验数据经X2统计处理，进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 电压对电转染效果的影响

由表1可见，24 h和48 h观察结果均以800 V/cm处理的电转染率最低，1 200 V/cm处理的电转染率最高，两者差异极显著（P<0.01）；24 h时，1 000 V/cm处理与1 200、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 200 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）；48 h时，1 200 V/cm处理与1 000、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 000 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）。可见不同电压的电转染效果差别较大，以1 200 V/cm处理的电转染率效果最好。

2.2 脉冲时间对电转染效果的影响

由表2可见，24 h时，脉冲时间为5 ms时其电转染率显著（P<0.05）低于其他3组，其他3组间差异不显著，可能由于5 ms电脉冲时间长细胞死亡比较多，电转染率反而降低；而48 h时，脉冲时间为2、3 ms组的电转染率显著（P<0.05）高于脉冲时间4、5 ms组，说明电击时间对瞬时转染效果影响明显，最适脉冲时间以3 ms为宜。

2.3 pEGFP—N1浓度对电转染效果的影响

由表3可见，在24和48 h时，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加时其转染效率最高，以2 mg/mL添加时其转染效率最低，两者之间差异极显著（P<0.01）；48 h观察，pEGFP-N1浓度为3、4、5 mg/mL时，其电转染率间差异均不显著，说明pEGFP-N1浓度达到一定值，对总体转染效率的影响较小。综合分析后认为pEGFP-N1添加量以4 mg/mL为宜。

3 小结与讨论

本试验结果表明，用pEGFP-N1作为目的基因，对原代猪成纤维细胞电转染的最佳条件为：电压1 200 V/cm，脉冲时间3 ms，pEGFP-N1添加量为4 mg/mL。

体细胞克隆体系所用的供体细胞代次越低越有利于克隆，然而体细胞建系、保存、复苏、转基因、筛选等过程都在增加细胞的代数，而细胞代数越高越不利于克隆；如果能在原代细胞中进行转基因，将使转基因克隆的供体细胞代次大幅度降低，从而提高克隆效率[2]。从本试验的结果看，这一方案是可行的。原代细胞为混杂细胞又比较脆弱、不稳定，故转染条件无法沿用纯化建系的细胞，本试验中，在800～1 400 V/cm电压间处理，随着电压升高，转染率也随之提高，在1 200 V/cm时达到最高值，之后电压升高，转染率反而降低，这与纯化细胞系有所不同[5]。而电转染脉冲时间在2～5 ms间，出现短时间电击效率高、长时间电击效率低的现象，即2～3 ms时电转染效率高，4～5 ms时电转染效率低，这一结果有别于季索菲[2]、张庆晓等[5]、谷瑞环等[6]的电转染数据，其原因可能是原代细胞太脆弱，难以承受长时间的电击[7]。不过pEGFP-N1浓度似乎对原代细胞的电转染率影响较小，当其浓度达到一定值后，其电转染率间无显著差异，这一点与传代的细胞系相似[1，7]。从试验结果和上述分析不难发现，原代细胞可以转基因，只是电转染参数有别于传代的细胞系。原代细胞电转染基因后，若细胞筛选、单克隆挑选、阳性细胞扩繁等与细胞纯化过程同时进行的，可以使供体细胞减少2～5个代次和1次冷冻过程，从而起到提高转基因体细胞克隆效率的作用。

参考文献：

[1] 钱 锋，肖成组.电击缓冲液对哺乳动物细胞电穿孔效率的影响[J].军事医学科学院院刊，1999，23（2）：101-103.

[2] 季索菲.猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化[J].合肥：安徽农业大学，2011.

[3] 朱剑锋，张广森，龚凡杰，等.电穿孔法基因转染K562细胞条件的优化[J].实用临床医药杂志，2008，12（5）：43-45.

[4] 宋永利，陆 昕，邱 爽，等.巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化[J].西北农业学报，2010，19（9）：21-24.

[5] 张庆晓，王慧利，孟春花，等.电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化[J].江苏农业科学，2012，40（12）：202-204.

[6] 谷瑞环，李善刚，宋伟杰，等.电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究[J].实验动物与比较医学，2010，30（4）：241-245.

[7] 徐 峰，吕 杨，谢院生，等.原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证[J].军需进修学院学报，2010，31（5）：459-461.

1.6 试验设计

1）不同电压对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定电脉冲时间为3 ms，分别在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4个电压条件下电转染，再分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以探索最佳电压参数。

2）不同脉冲时间对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V，在2、3、4、5 ms 4个脉冲时间进行电转染，分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的脉冲时间。

3）不同浓度的pEGFP-N1对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中分别按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V， 电脉冲时间为3 ms进行电转染，再分别于电转染后的24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的pEGFP-N1浓度。

以上每种试验均重复3次，结果取平均值。试验数据经X2统计处理，进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 电压对电转染效果的影响

由表1可见，24 h和48 h观察结果均以800 V/cm处理的电转染率最低，1 200 V/cm处理的电转染率最高，两者差异极显著（P<0.01）；24 h时，1 000 V/cm处理与1 200、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 200 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）；48 h时，1 200 V/cm处理与1 000、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 000 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）。可见不同电压的电转染效果差别较大，以1 200 V/cm处理的电转染率效果最好。

2.2 脉冲时间对电转染效果的影响

由表2可见，24 h时，脉冲时间为5 ms时其电转染率显著（P<0.05）低于其他3组，其他3组间差异不显著，可能由于5 ms电脉冲时间长细胞死亡比较多，电转染率反而降低；而48 h时，脉冲时间为2、3 ms组的电转染率显著（P<0.05）高于脉冲时间4、5 ms组，说明电击时间对瞬时转染效果影响明显，最适脉冲时间以3 ms为宜。

2.3 pEGFP—N1浓度对电转染效果的影响

由表3可见，在24和48 h时，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加时其转染效率最高，以2 mg/mL添加时其转染效率最低，两者之间差异极显著（P<0.01）；48 h观察，pEGFP-N1浓度为3、4、5 mg/mL时，其电转染率间差异均不显著，说明pEGFP-N1浓度达到一定值，对总体转染效率的影响较小。综合分析后认为pEGFP-N1添加量以4 mg/mL为宜。

3 小结与讨论

本试验结果表明，用pEGFP-N1作为目的基因，对原代猪成纤维细胞电转染的最佳条件为：电压1 200 V/cm，脉冲时间3 ms，pEGFP-N1添加量为4 mg/mL。

体细胞克隆体系所用的供体细胞代次越低越有利于克隆，然而体细胞建系、保存、复苏、转基因、筛选等过程都在增加细胞的代数，而细胞代数越高越不利于克隆；如果能在原代细胞中进行转基因，将使转基因克隆的供体细胞代次大幅度降低，从而提高克隆效率[2]。从本试验的结果看，这一方案是可行的。原代细胞为混杂细胞又比较脆弱、不稳定，故转染条件无法沿用纯化建系的细胞，本试验中，在800～1 400 V/cm电压间处理，随着电压升高，转染率也随之提高，在1 200 V/cm时达到最高值，之后电压升高，转染率反而降低，这与纯化细胞系有所不同[5]。而电转染脉冲时间在2～5 ms间，出现短时间电击效率高、长时间电击效率低的现象，即2～3 ms时电转染效率高，4～5 ms时电转染效率低，这一结果有别于季索菲[2]、张庆晓等[5]、谷瑞环等[6]的电转染数据，其原因可能是原代细胞太脆弱，难以承受长时间的电击[7]。不过pEGFP-N1浓度似乎对原代细胞的电转染率影响较小，当其浓度达到一定值后，其电转染率间无显著差异，这一点与传代的细胞系相似[1，7]。从试验结果和上述分析不难发现，原代细胞可以转基因，只是电转染参数有别于传代的细胞系。原代细胞电转染基因后，若细胞筛选、单克隆挑选、阳性细胞扩繁等与细胞纯化过程同时进行的，可以使供体细胞减少2～5个代次和1次冷冻过程，从而起到提高转基因体细胞克隆效率的作用。

参考文献：

[1] 钱 锋，肖成组.电击缓冲液对哺乳动物细胞电穿孔效率的影响[J].军事医学科学院院刊，1999，23（2）：101-103.

[2] 季索菲.猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化[J].合肥：安徽农业大学，2011.

[3] 朱剑锋，张广森，龚凡杰，等.电穿孔法基因转染K562细胞条件的优化[J].实用临床医药杂志，2008，12（5）：43-45.

[4] 宋永利，陆 昕，邱 爽，等.巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化[J].西北农业学报，2010，19（9）：21-24.

[5] 张庆晓，王慧利，孟春花，等.电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化[J].江苏农业科学，2012，40（12）：202-204.

[6] 谷瑞环，李善刚，宋伟杰，等.电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究[J].实验动物与比较医学，2010，30（4）：241-245.

[7] 徐 峰，吕 杨，谢院生，等.原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证[J].军需进修学院学报，2010，31（5）：459-461.

1.6 试验设计

1）不同电压对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL 添加pEGFP-N1，固定电脉冲时间为3 ms，分别在800、1 000、1 200、1 400 V/cm 4个电压条件下电转染，再分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以探索最佳电压参数。

2）不同脉冲时间对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中按4 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V，在2、3、4、5 ms 4个脉冲时间进行电转染，分别于24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的脉冲时间。

3）不同浓度的pEGFP-N1对电转染效果的影响。在准备好的电转染细胞中分别按2、3、4、5 mg/mL添加pEGFP-N1，固定电压为1 200 V， 电脉冲时间为3 ms进行电转染，再分别于电转染后的24、48 h在荧光显微镜下观察计数，以确定最适的pEGFP-N1浓度。

以上每种试验均重复3次，结果取平均值。试验数据经X2统计处理，进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 电压对电转染效果的影响

由表1可见，24 h和48 h观察结果均以800 V/cm处理的电转染率最低，1 200 V/cm处理的电转染率最高，两者差异极显著（P<0.01）；24 h时，1 000 V/cm处理与1 200、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 200 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）；48 h时，1 200 V/cm处理与1 000、1 400 V/cm处理间差异显著（P<0.05），1 000 V/cm处理与1 400 V/cm处理间差异不显著（P>0.05）。可见不同电压的电转染效果差别较大，以1 200 V/cm处理的电转染率效果最好。

2.2 脉冲时间对电转染效果的影响

由表2可见，24 h时，脉冲时间为5 ms时其电转染率显著（P<0.05）低于其他3组，其他3组间差异不显著，可能由于5 ms电脉冲时间长细胞死亡比较多，电转染率反而降低；而48 h时，脉冲时间为2、3 ms组的电转染率显著（P<0.05）高于脉冲时间4、5 ms组，说明电击时间对瞬时转染效果影响明显，最适脉冲时间以3 ms为宜。

2.3 pEGFP—N1浓度对电转染效果的影响

由表3可见，在24和48 h时，pEGFP-N1均以4 mg/mL添加时其转染效率最高，以2 mg/mL添加时其转染效率最低，两者之间差异极显著（P<0.01）；48 h观察，pEGFP-N1浓度为3、4、5 mg/mL时，其电转染率间差异均不显著，说明pEGFP-N1浓度达到一定值，对总体转染效率的影响较小。综合分析后认为pEGFP-N1添加量以4 mg/mL为宜。

3 小结与讨论

本试验结果表明，用pEGFP-N1作为目的基因，对原代猪成纤维细胞电转染的最佳条件为：电压1 200 V/cm，脉冲时间3 ms，pEGFP-N1添加量为4 mg/mL。

体细胞克隆体系所用的供体细胞代次越低越有利于克隆，然而体细胞建系、保存、复苏、转基因、筛选等过程都在增加细胞的代数，而细胞代数越高越不利于克隆；如果能在原代细胞中进行转基因，将使转基因克隆的供体细胞代次大幅度降低，从而提高克隆效率[2]。从本试验的结果看，这一方案是可行的。原代细胞为混杂细胞又比较脆弱、不稳定，故转染条件无法沿用纯化建系的细胞，本试验中，在800～1 400 V/cm电压间处理，随着电压升高，转染率也随之提高，在1 200 V/cm时达到最高值，之后电压升高，转染率反而降低，这与纯化细胞系有所不同[5]。而电转染脉冲时间在2～5 ms间，出现短时间电击效率高、长时间电击效率低的现象，即2～3 ms时电转染效率高，4～5 ms时电转染效率低，这一结果有别于季索菲[2]、张庆晓等[5]、谷瑞环等[6]的电转染数据，其原因可能是原代细胞太脆弱，难以承受长时间的电击[7]。不过pEGFP-N1浓度似乎对原代细胞的电转染率影响较小，当其浓度达到一定值后，其电转染率间无显著差异，这一点与传代的细胞系相似[1，7]。从试验结果和上述分析不难发现，原代细胞可以转基因，只是电转染参数有别于传代的细胞系。原代细胞电转染基因后，若细胞筛选、单克隆挑选、阳性细胞扩繁等与细胞纯化过程同时进行的，可以使供体细胞减少2～5个代次和1次冷冻过程，从而起到提高转基因体细胞克隆效率的作用。

参考文献：

[1] 钱 锋，肖成组.电击缓冲液对哺乳动物细胞电穿孔效率的影响[J].军事医学科学院院刊，1999，23（2）：101-103.

[2] 季索菲.猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化[J].合肥：安徽农业大学，2011.

[3] 朱剑锋，张广森，龚凡杰，等.电穿孔法基因转染K562细胞条件的优化[J].实用临床医药杂志，2008，12（5）：43-45.

[4] 宋永利，陆 昕，邱 爽，等.巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化[J].西北农业学报，2010，19（9）：21-24.

[5] 张庆晓，王慧利，孟春花，等.电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化[J].江苏农业科学，2012，40（12）：202-204.

[6] 谷瑞环，李善刚，宋伟杰，等.电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究[J].实验动物与比较医学，2010，30（4）：241-245.

[7] 徐 峰，吕 杨，谢院生，等.原代大鼠肾小球系膜细胞最佳电转染条件的探索和验证[J].军需进修学院学报，2010，31（5）：459-461.