一株鸭瘟病毒的分离与鉴定

付书林+陈夏冰+钱运国+张大丙+杨文海+何斌+金尔光+童伟文+叶胜强+刘武+陶弼菲+陈洁

摘要：从湖北省武汉市某种鸭场送检的死亡鸭肝脏中分离到1株病毒，结合流行病学调查，剖检病理变化特征初步诊断为鸭瘟病毒感染。根据GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对引物，提取病毒核酸DNA进行PCR扩增，得到大小约为416 bp的目的片段。测序结果表明与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因的序列相似性达到99%。鸭胚感染试验表明，感染的鸭胚在第四天开始死亡，并出现典型的鸭瘟病毒感染症状。上述结果表明，该种鸭场种鸭死亡是由鸭瘟病毒所引起的。

关键词：鸭瘟；鸭瘟病毒；分离；鉴定

中图分类号：S852.65+9.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4644-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.036

Isolation and Identification of One Duck Plague Virus Strain

FU Shu-lin1， CHEN Xia-bing1， QIAN Yun-guo2， ZHANG Da-bing3， YANG Wen-hai1， HE Bin1， JIN Er-guang1， TONG Wei-wen1， YE Sheng-qiang1， LIU Wu1， TAO Bi-fei1， CHEN Jie1

（1. Wuhan Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Wuhan 430208，China； 2.Wuhan Vegetable Research Institute， Wuhan 430208， China； 3. College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： One virus strain was isolated from the liver of the dead ducks in a farm of Wuhan city， Hubei province. Combined with epidemiological investigation and autopsy pathology， it was initially diagnosed as duck plague virus infection. Based on the sequences of plague virus gene in GenBank of UL6 gene， one pair of primers was designed and used to PCR amplification of extracted viral nucleic acids DNA. The PCR products were 416 bp and the similarity was 99% compared with the gene sequence of the Duck Plague Virus UL6 gene published. The duck embryo infection experiment showed that duck embryos began to die in the first four days， with typical symptoms of the duck plague virus infection. It is indicated that the case was the infection of duck plague virus.

Key words： duck plague； duck plague virus； isolation； identification

鸭瘟（Duck plague），又名鸭病毒性肠炎（Duck virusenteritis， DVE），是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病[1]。其特征是流行广泛，传播较迅速，发病率和死亡率较高。鸭瘟临床表现为精神沉郁、高热稽留、两腿麻痹、下痢、流泪和部分发病鸭头颈肿大[2]。该病病原为鸭瘟病毒（Duck plague virus），属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，核酸类型为线状双股DNA[3]。由于对鸭瘟病毒的分子生物学研究相对滞后，基因的功能研究严重滞后，因此目前该病的诊断主要依赖于流行病学、临床症状、病理变化和病毒的分离、鉴定。但是目前国内外学者已经建立了一些分子生物学方法对鸭瘟病毒进行鉴别诊断。陈安莉等[4]建立了二重PCR方法能够区别新城疫病毒和鸭瘟病毒的感染，张艳芳等[5]建立了二重荧光定量RT-PCR方法区分鸭黄病毒和鸭瘟病毒的感染。

本研究根据GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对PCR引物，成功扩增出目的基因，并通过鸭胚感染试验证实了鸭瘟病毒在临床上的感染。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用9～10日龄樱桃谷鸭胚由武汉市畜牧兽医科学研究所自行孵化；病毒基因组DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品；DL Marker 2000、Taq酶均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料收集与处理 送检病料来自湖北省武汉市某种鸭场40周龄樱桃谷种鸭。采集病鸭的肝脏组织捣碎，并按照质量体积比1∶5的比例加入无菌的PBS液混匀进行组织匀浆，然后以4 000 r/min离心10 min，取上清液并用无菌PBS液稀释作为接种鸭胚的材料。

1.2.2 病毒DNA提取 取送检死亡的病鸭肝脏，加入无菌的PBS液进行组织匀浆，以4 000 r/min离心10 min，取上清液，然后按照病毒基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作。

1.2.3 引物设计与合成 根据GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对PCR引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小为416 bp。

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增反应体系采用25 μL反应体系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，灭菌水5.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR产物于0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.5 测序与序列分析 将PCR产物用DNA回收试剂盒进行纯化回收，并送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。使用DNA Star软件将测序结果与GenBank上公布的UL6基因序列进行比对分析。

1.2.6 鸭胚感染试验 将16只9～10日龄的鸭胚随机分为2组，每组8只。第一组每只鸭胚接种0.2 mL的病毒稀释液。第二组每只鸭胚接种0.2 mL的无菌PBS液（阴性对照）。培养并观察鸭胚死亡情况和病变情况。

2 结果与分析

2.1 鸭瘟病毒的PCR鉴定结果

用设计合成的针对鸭瘟病毒UL6基因核苷酸序列扩增引物对提取的鸭瘟病毒DNA进行PCR扩增后，扩增产物出现一条约416 bp大小的条带，与预期片段大小相符（图1）。

2.2 鸭瘟病毒UL6基因序列测定分析结果

将所测定的序列通过DNAMAN软件与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列进行比对分析，结果表明所鉴定病毒的UL6基因序列与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列的相似性达到99%（图2）。

2.3 鸭胚感染试验结果

接种后4 d，攻毒组的鸭胚开始出现死亡，在第六天8只鸭胚全部死亡，而阴性对照组的鸭胚没有出现死亡（图3）。死亡的鸭胚全身水肿，出血，绒毛尿囊膜有灰白色坏死点，肝脏有坏死灶出现。

3 小结与讨论

鸭瘟病毒在临床上造成的死亡情况有较大的差别。不同年龄、性别和品种的鸭均易感。鸭瘟病毒感染鸭后，可侵害鸭的多种组织器官，为全身各组织感染和广泛的组织嗜性创造条件[6]。本研究中送检的病鸭拉绿色稀粪，泄殖腔严重充血、出血、水肿；食道黏膜出血，肝脏肿大，表面有灰白色的坏死点，心内膜与心外膜有出血斑点，这与报道的鸭瘟的临床症状、病理变化等相一致[7]。进一步通过扩增鸭瘟的UL6基因和鸭胚感染试验证实送检的病例为鸭瘟病毒感染。

鸭瘟病毒的天然宿主为鸭、鹅和天鹅，7日龄到成年种鸭均可感染[1]。鸭瘟病毒不能直接使用于鸡胚，因此本研究中感染动物为鸭胚。在本研究中，感染病毒的鸭胚在感染后4～6 d内全部死亡，鸭胚感染后出现典型的鸭瘟病毒感染的病理变化特征。

本研究中根据GenBank上已经公布的鸭瘟病毒UL6基因序列，设计合成一对引物，通过PCR方法特异性扩增出416 bp的片段。将扩增出的基因片段与公布的基因序列相比较，两者的相似性为99%。但是，鸭瘟病毒的UL6基因序列在鸭瘟病毒的致病过程中起何作用还有待进一步研究。

参考文献：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

[2] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭后动态病理组织学变化[J].中国兽医学报，2013，33（1）：9-15.

[3] 郭玉璞，蒋金书.鸭病[M].北京：北京农业大学出版社，1988. 21-28.

[4] 陈安莉，谢芝勋，谢丽基，等.新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2013，40（11）： 192-195.

[5] 张艳芳，谢芝勋，谢丽基，等.鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立[A].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第十五次学术研讨会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会传染病学分会，2013.899-903.

[6] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒对SPF鸭的致病性研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余爱花，杨 阳，张宝来，等.鸭瘟病毒YZH株的分离鉴定及其TK基因的序列分析[J].动物医学进展，2012，33（12）：133-137.

1.2.3 引物设计与合成 根据GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对PCR引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小为416 bp。

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增反应体系采用25 μL反应体系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，灭菌水5.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR产物于0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.5 测序与序列分析 将PCR产物用DNA回收试剂盒进行纯化回收，并送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。使用DNA Star软件将测序结果与GenBank上公布的UL6基因序列进行比对分析。

1.2.6 鸭胚感染试验 将16只9～10日龄的鸭胚随机分为2组，每组8只。第一组每只鸭胚接种0.2 mL的病毒稀释液。第二组每只鸭胚接种0.2 mL的无菌PBS液（阴性对照）。培养并观察鸭胚死亡情况和病变情况。

2 结果与分析

2.1 鸭瘟病毒的PCR鉴定结果

用设计合成的针对鸭瘟病毒UL6基因核苷酸序列扩增引物对提取的鸭瘟病毒DNA进行PCR扩增后，扩增产物出现一条约416 bp大小的条带，与预期片段大小相符（图1）。

2.2 鸭瘟病毒UL6基因序列测定分析结果

将所测定的序列通过DNAMAN软件与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列进行比对分析，结果表明所鉴定病毒的UL6基因序列与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列的相似性达到99%（图2）。

2.3 鸭胚感染试验结果

接种后4 d，攻毒组的鸭胚开始出现死亡，在第六天8只鸭胚全部死亡，而阴性对照组的鸭胚没有出现死亡（图3）。死亡的鸭胚全身水肿，出血，绒毛尿囊膜有灰白色坏死点，肝脏有坏死灶出现。

3 小结与讨论

鸭瘟病毒在临床上造成的死亡情况有较大的差别。不同年龄、性别和品种的鸭均易感。鸭瘟病毒感染鸭后，可侵害鸭的多种组织器官，为全身各组织感染和广泛的组织嗜性创造条件[6]。本研究中送检的病鸭拉绿色稀粪，泄殖腔严重充血、出血、水肿；食道黏膜出血，肝脏肿大，表面有灰白色的坏死点，心内膜与心外膜有出血斑点，这与报道的鸭瘟的临床症状、病理变化等相一致[7]。进一步通过扩增鸭瘟的UL6基因和鸭胚感染试验证实送检的病例为鸭瘟病毒感染。

鸭瘟病毒的天然宿主为鸭、鹅和天鹅，7日龄到成年种鸭均可感染[1]。鸭瘟病毒不能直接使用于鸡胚，因此本研究中感染动物为鸭胚。在本研究中，感染病毒的鸭胚在感染后4～6 d内全部死亡，鸭胚感染后出现典型的鸭瘟病毒感染的病理变化特征。

本研究中根据GenBank上已经公布的鸭瘟病毒UL6基因序列，设计合成一对引物，通过PCR方法特异性扩增出416 bp的片段。将扩增出的基因片段与公布的基因序列相比较，两者的相似性为99%。但是，鸭瘟病毒的UL6基因序列在鸭瘟病毒的致病过程中起何作用还有待进一步研究。

参考文献：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

[2] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭后动态病理组织学变化[J].中国兽医学报，2013，33（1）：9-15.

[3] 郭玉璞，蒋金书.鸭病[M].北京：北京农业大学出版社，1988. 21-28.

[4] 陈安莉，谢芝勋，谢丽基，等.新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2013，40（11）： 192-195.

[5] 张艳芳，谢芝勋，谢丽基，等.鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立[A].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第十五次学术研讨会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会传染病学分会，2013.899-903.

[6] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒对SPF鸭的致病性研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余爱花，杨 阳，张宝来，等.鸭瘟病毒YZH株的分离鉴定及其TK基因的序列分析[J].动物医学进展，2012，33（12）：133-137.

1.2.3 引物设计与合成 根据GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列设计一对PCR引物，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。上游引物P1：5′-GAGCGTATTTAGATGAAACTGC-3′，下游引物P2：5′-TGTTGTGATTGTTCC-3′。目的片段大小为416 bp。

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增反应体系采用25 μL反应体系。2×Premix Taq DNA酶12.5 μL，上下游引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板5 μL，灭菌水5.5 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 30 min。PCR产物于0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.5 测序与序列分析 将PCR产物用DNA回收试剂盒进行纯化回收，并送宝生物工程（大连）有限公司进行测序。使用DNA Star软件将测序结果与GenBank上公布的UL6基因序列进行比对分析。

1.2.6 鸭胚感染试验 将16只9～10日龄的鸭胚随机分为2组，每组8只。第一组每只鸭胚接种0.2 mL的病毒稀释液。第二组每只鸭胚接种0.2 mL的无菌PBS液（阴性对照）。培养并观察鸭胚死亡情况和病变情况。

2 结果与分析

2.1 鸭瘟病毒的PCR鉴定结果

用设计合成的针对鸭瘟病毒UL6基因核苷酸序列扩增引物对提取的鸭瘟病毒DNA进行PCR扩增后，扩增产物出现一条约416 bp大小的条带，与预期片段大小相符（图1）。

2.2 鸭瘟病毒UL6基因序列测定分析结果

将所测定的序列通过DNAMAN软件与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列进行比对分析，结果表明所鉴定病毒的UL6基因序列与GenBank上公布的鸭瘟病毒UL6基因序列的相似性达到99%（图2）。

2.3 鸭胚感染试验结果

接种后4 d，攻毒组的鸭胚开始出现死亡，在第六天8只鸭胚全部死亡，而阴性对照组的鸭胚没有出现死亡（图3）。死亡的鸭胚全身水肿，出血，绒毛尿囊膜有灰白色坏死点，肝脏有坏死灶出现。

3 小结与讨论

鸭瘟病毒在临床上造成的死亡情况有较大的差别。不同年龄、性别和品种的鸭均易感。鸭瘟病毒感染鸭后，可侵害鸭的多种组织器官，为全身各组织感染和广泛的组织嗜性创造条件[6]。本研究中送检的病鸭拉绿色稀粪，泄殖腔严重充血、出血、水肿；食道黏膜出血，肝脏肿大，表面有灰白色的坏死点，心内膜与心外膜有出血斑点，这与报道的鸭瘟的临床症状、病理变化等相一致[7]。进一步通过扩增鸭瘟的UL6基因和鸭胚感染试验证实送检的病例为鸭瘟病毒感染。

鸭瘟病毒的天然宿主为鸭、鹅和天鹅，7日龄到成年种鸭均可感染[1]。鸭瘟病毒不能直接使用于鸡胚，因此本研究中感染动物为鸭胚。在本研究中，感染病毒的鸭胚在感染后4～6 d内全部死亡，鸭胚感染后出现典型的鸭瘟病毒感染的病理变化特征。

本研究中根据GenBank上已经公布的鸭瘟病毒UL6基因序列，设计合成一对引物，通过PCR方法特异性扩增出416 bp的片段。将扩增出的基因片段与公布的基因序列相比较，两者的相似性为99%。但是，鸭瘟病毒的UL6基因序列在鸭瘟病毒的致病过程中起何作用还有待进一步研究。

参考文献：

[1] SANDHU T S， SHAWKY S A. Duck virus enteritis （duck plague）[M]. Ames： Iowa State University Press， 2003.354-363.

[2] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭后动态病理组织学变化[J].中国兽医学报，2013，33（1）：9-15.

[3] 郭玉璞，蒋金书.鸭病[M].北京：北京农业大学出版社，1988. 21-28.

[4] 陈安莉，谢芝勋，谢丽基，等.新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医，2013，40（11）： 192-195.

[5] 张艳芳，谢芝勋，谢丽基，等.鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立[A].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第十五次学术研讨会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会传染病学分会，2013.899-903.

[6] 张 坤，刁有祥，程彦丽，等.鸭瘟病毒对SPF鸭的致病性研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（7）：51-58.

[7] 余爱花，杨 阳，张宝来，等.鸭瘟病毒YZH株的分离鉴定及其TK基因的序列分析[J].动物医学进展，2012，33（12）：133-137.