对溴苯甲醛—4—苯基—2—噻唑脲与人血清蛋白相互作用的研究

林枫+杨水兰+李明

摘要：采用荧光法研究了对溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP）与人血清蛋白（HSA）之间的相互作用。根据溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲与HSA相互作用的荧光敏华作用，利用Stern-Volmer方程及非辐射能量转移理论处理试验数据，采用同步荧光光谱探讨了BHP对HSA构象的影响。结果表明，BHP可以使HSA的荧光增强，表明两者之间发生了能量转移，能量转移的机理是BHP与HSA结合形成了复合物。荧光增强（敏化）效应主要源于给体-受体间的偶极-偶极作用的能量转移。能量转移的结果为内原发色基团（给体donor）的荧光被猝灭和外源发色基团（受体 acceptor）荧光被敏化，计算得到其敏化常数为 -2.494 5×104。同步荧光光谱表明，相互作用引起HSA构象变化，提示结合位点更接近于色氨酸。

关键词：对溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲；人血清蛋白；荧光光谱；同步荧光光谱

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4578-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.017

The Interaction Between （E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole and Albumin Human

LIN Feng， YANG Shui-lan， LI Ming

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Ningxia University，Yinchuan 750021， China）

Abstract： To study the interaction between（E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole （BHP） and Albumin Human by fluorescence， the Stern - Volmer curve and theory of non - radiation energy transfer was used to deal with the dates of fluorescence quench. The synchronous spectrum was used to investigate the conformational changes of HSA. Results showed that BHP enhanced the fluorescence of HSA. The mechanism of energy transfer was that BHP formed complexes with HSA. Fluorescence enhancement （sensitization effect） stemed mainly from the donor - the dipole-dipole effect between receptor and energy transfer. Fluorescence of the primary base group （to the body donor） was quenched and that of exogenous basement regiment receptors （acceptor） was sensitized. The sensitization constant was-2.494 5×104. Synchronous fluorescence spectra showed that the interaction caused change of HSA conformation， prompting binding sites closer to tryptophan.

Key words： （E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole； Albumin Human； fluorescence spectroscopy； Synchronous fluorescence spectrum

对溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP）具有低毒、优良的生物活性和结构变化多样等特点，在医药、材料和农业领域具有广泛的生物活性，该类农药已商品化，许多含吡唑基团的化合物具有良好的除草、杀虫、杀菌等[1，2]活性。BHP具有多个共轭双键结构、有荧光，有可能可以和DNA相互作用[3]，血清白蛋白是由许多氨基酸聚合而成的生物大分子化合物，其与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动等密切相关。当药物进入血液后，可以高亲和性与血清白蛋白可逆性结合，形成药物-蛋白复合物。因此本研究试图用荧光光谱法研究其与HSA相互作用的情况。有助于从分子水平上了解药物在体内的转运和代谢过程以及进一步阐明药物在人体内的作用机制，药物代谢动力学和蛋白质构象的变化。不但对DNA的快速定量检测、开发临床诊断试剂方面有重要的意义，而且对阐述噻唑衍生物作为杀虫剂的作用机理、新药的设计研究有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：F-4600荧光分光光度计，1.0 cm×1.0 cm石英荧光比色皿（晶科）； pH计；电子分析天平。PHS-3通用型酸度计（成都市三可仪器有限公司）。试剂：HSA（Sigma公司），用去离子水配制成1.0×10-5 mol/L的储备液；对溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP，实验室自行合成[4，5]），用去离子水配制成1.120×10-4 mol/L的储备液； 三羟基甲氧基氨基甲烷（Tris）、盐酸均为分析纯，配制0.05 mol/L，pH 7.4的缓冲溶液。

1.2 试验方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA储备液及0.2 mL 0.1 mol/L缓冲液，依次加入不同量的BHP，反应5 min。选择激发波长为280 nm，激发和发射通带均为10 nm。记录300～400 nm的荧光光谱；固定激发和发射波长间隔Δλ分别为20 nm和60 nm，记录同步荧光光谱[6，7]。

2 结果与分析

2.1 荧光敏化光谱

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，改变BHP的浓度时的HSA荧光发射光谱如图1所示。从图1中可以看出，在波长283 nm下，随着BHP浓度的增大，HSA的荧光强度逐渐增强，初步表明BHP具有荧光敏化效应。2.2 BHP与HSA相互作用的敏化机理

许多药物具有荧光，在加入蛋白质后药物的荧光会增强，还有一些药物加入到蛋白质溶液后会使蛋白质荧光增强或有新的荧光峰出现，因此可以利用荧光增强研究蛋白质分子与药物的相互作用[8，9]。荧光增强（敏化）效应主要源于给体-受体间的偶极-偶极作用的能量转移。能量转移的结果为内原发色基团（给体donor）的荧光被猝灭和外源发色基团（受体 acceptor）荧光被敏化。

2.3 敏化常数的确定

根据实验数据及绘制的图形，能很清楚的看到加入药物后荧光强度明显的增强。根据文献[1]的观点，用荧光加强公式来研究药物对蛋白质的猝灭作用也能够得到非常好的结果，尽管两个理论公式的表观形式不同，但所得结果却很接近.这表明两个理论方程的等效性和合理性以及所得结果的可信度，所以也可以用荧光猝灭的公式来研究荧光敏化作用[10，11]。

荧光猝灭光谱法研究化学和生物体系的有效手段是根据Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F0和F分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度，Kq为双分子猝灭速率，τ0是不存在猝灭剂时荧光体的荧光寿命，Ksv是Stem-Volmer猝灭常数。为了阐明其敏化机理，作出温度为20 ℃下HSA与BHP作用的stem-Voliner图（图2）。

从图2中可以看出曲线有良好的线性关系，直线斜率为负值即Ksv为负值，表明不存在药物时HSA的荧光强度比存在药物时的小，进一步证明此药物会使HSA的荧光强度增强，即表现为荧光敏化。由于生物大分子的荧光寿命τ0约为10-8 s，根据Kq=Ksv/τ0，故猝灭速率常数Kq的数量级可以达到1 012 L/（mol·s）。一般认为，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2×l 010 L/（mol·s），显然，Kq也为负值，更进一步证明此药物使HSA的荧光强度增强。

2.4 BHP对HSA构象的影响

同步荧光光谱因具有简化光谱、窄化谱带和减小光谱重叠等优点而常被用于研究药物分子对蛋白质构象的影响。同步荧光光谱可以反应药物分子对蛋白质构象的影响，固定激发波长和发射波长的间距Δλ，同步扫描激发波和发射波即可得到同步荧光光谱（图3、图4）。

蛋白质的荧光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸产生的荧光所共同形成的。在同步扫描过程中，当波长差Δλ=15 nm时，只表现出酪氨酸残基的荧光（图3）；随着药物的加入，最大发射波长有轻微的蓝移，说明由于药物与HSA的作用，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增强。

当Δλ=60 nm时，主要是色氨酸残基发射的荧光。而色氨酸的最大荧光发射波长与其所处的介质环境有关。从Δλ=60 nm的同步荧光光谱图4中可以看出，色氨酸残基的发射波长有轻微的红移，证明HSA腔内疏水环境的极性增大，疏水性减弱，肽链的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白质构象的变化。

3 小结与讨论

通过荧光光谱法研究BHP与HSA的相互作用，得到了良好的敏化现象。同时研究同步荧光光谱得出BHP使HSA构象发生变化。需要指出的是，用荧光猝灭理论的公式研究荧光敏化是假定给体与受体之间生成了结合物，即在药物低浓度时基本属于加强。研究药物与血清白蛋白的相互作用，有助于从分子水平上了解药物在体内的转运和代谢过程以及进一步阐明药物在人体内的作用机制，药物代谢动力学和蛋白质构象的变化。

参考文献：

[1] 戴 红，赵元飞，牛 平，等.1-{4-[（2-氰基亚胺基-1，3-噻唑烷-3-基）甲基]-噻唑-2-基}-3-取代苯甲酰基脲类化合物的合成及其生物活性[J].有机化学，2013（33）：1568-1572.

[2] 崔胜峰，王 艳，吕 敬，等.噻唑类化合物应用研究新进展[J].中国科学，2012，42（8）：1105-1131.

[3] 王平红.一些金属配合物和DNA相互作用的研究[D].海口：海南大学，2006.

[4] 阿布拉江·克依木，王立举.3-（2-萘基）-1-苯基-吡唑-4-甲醛腙衍生物的简便合成与表征[J].有机化学，2012（32）：2358-2362.

[5] 李 明.甲钴胺的合成研究与缩氨基硫脲及其衍生物的合成[D].银川：宁夏大学，2008.

[6] 邢惟青，黄鹏翔，丘玉昌，等.现代荧光光谱法在药物与蛋白相互作用研究中的应用[J].华西医药杂志，2011，26（5）：503-507.

[7] 孙 洋，樊 君，胡晓云，等.荧光素钠与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究及其分析应用[J].化学学报，2011，69（8）：937-944.

[8] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究抗癌药物羟基喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用[J]药物分析杂志，2010，30（1）：59-62.

[9] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究大豆甙元与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科学学报，2011，27（5）：623-626.

[10] 苏碧泉.芦丁金属配合物与相互作用研究[D].兰州：西北师范大学，2006.

[11] 杨曼曼，席小莉.用荧光猝灭和荧光加强两种理论研究喹诺酮类新药与白蛋白的作用[J].高等化学学报，2006（4）：687-691.

1.2 试验方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA储备液及0.2 mL 0.1 mol/L缓冲液，依次加入不同量的BHP，反应5 min。选择激发波长为280 nm，激发和发射通带均为10 nm。记录300～400 nm的荧光光谱；固定激发和发射波长间隔Δλ分别为20 nm和60 nm，记录同步荧光光谱[6，7]。

2 结果与分析

2.1 荧光敏化光谱

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，改变BHP的浓度时的HSA荧光发射光谱如图1所示。从图1中可以看出，在波长283 nm下，随着BHP浓度的增大，HSA的荧光强度逐渐增强，初步表明BHP具有荧光敏化效应。2.2 BHP与HSA相互作用的敏化机理

许多药物具有荧光，在加入蛋白质后药物的荧光会增强，还有一些药物加入到蛋白质溶液后会使蛋白质荧光增强或有新的荧光峰出现，因此可以利用荧光增强研究蛋白质分子与药物的相互作用[8，9]。荧光增强（敏化）效应主要源于给体-受体间的偶极-偶极作用的能量转移。能量转移的结果为内原发色基团（给体donor）的荧光被猝灭和外源发色基团（受体 acceptor）荧光被敏化。

2.3 敏化常数的确定

根据实验数据及绘制的图形，能很清楚的看到加入药物后荧光强度明显的增强。根据文献[1]的观点，用荧光加强公式来研究药物对蛋白质的猝灭作用也能够得到非常好的结果，尽管两个理论公式的表观形式不同，但所得结果却很接近.这表明两个理论方程的等效性和合理性以及所得结果的可信度，所以也可以用荧光猝灭的公式来研究荧光敏化作用[10，11]。

荧光猝灭光谱法研究化学和生物体系的有效手段是根据Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F0和F分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度，Kq为双分子猝灭速率，τ0是不存在猝灭剂时荧光体的荧光寿命，Ksv是Stem-Volmer猝灭常数。为了阐明其敏化机理，作出温度为20 ℃下HSA与BHP作用的stem-Voliner图（图2）。

从图2中可以看出曲线有良好的线性关系，直线斜率为负值即Ksv为负值，表明不存在药物时HSA的荧光强度比存在药物时的小，进一步证明此药物会使HSA的荧光强度增强，即表现为荧光敏化。由于生物大分子的荧光寿命τ0约为10-8 s，根据Kq=Ksv/τ0，故猝灭速率常数Kq的数量级可以达到1 012 L/（mol·s）。一般认为，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2×l 010 L/（mol·s），显然，Kq也为负值，更进一步证明此药物使HSA的荧光强度增强。

2.4 BHP对HSA构象的影响

同步荧光光谱因具有简化光谱、窄化谱带和减小光谱重叠等优点而常被用于研究药物分子对蛋白质构象的影响。同步荧光光谱可以反应药物分子对蛋白质构象的影响，固定激发波长和发射波长的间距Δλ，同步扫描激发波和发射波即可得到同步荧光光谱（图3、图4）。

蛋白质的荧光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸产生的荧光所共同形成的。在同步扫描过程中，当波长差Δλ=15 nm时，只表现出酪氨酸残基的荧光（图3）；随着药物的加入，最大发射波长有轻微的蓝移，说明由于药物与HSA的作用，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增强。

当Δλ=60 nm时，主要是色氨酸残基发射的荧光。而色氨酸的最大荧光发射波长与其所处的介质环境有关。从Δλ=60 nm的同步荧光光谱图4中可以看出，色氨酸残基的发射波长有轻微的红移，证明HSA腔内疏水环境的极性增大，疏水性减弱，肽链的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白质构象的变化。

3 小结与讨论

通过荧光光谱法研究BHP与HSA的相互作用，得到了良好的敏化现象。同时研究同步荧光光谱得出BHP使HSA构象发生变化。需要指出的是，用荧光猝灭理论的公式研究荧光敏化是假定给体与受体之间生成了结合物，即在药物低浓度时基本属于加强。研究药物与血清白蛋白的相互作用，有助于从分子水平上了解药物在体内的转运和代谢过程以及进一步阐明药物在人体内的作用机制，药物代谢动力学和蛋白质构象的变化。

参考文献：

[1] 戴 红，赵元飞，牛 平，等.1-{4-[（2-氰基亚胺基-1，3-噻唑烷-3-基）甲基]-噻唑-2-基}-3-取代苯甲酰基脲类化合物的合成及其生物活性[J].有机化学，2013（33）：1568-1572.

[2] 崔胜峰，王 艳，吕 敬，等.噻唑类化合物应用研究新进展[J].中国科学，2012，42（8）：1105-1131.

[3] 王平红.一些金属配合物和DNA相互作用的研究[D].海口：海南大学，2006.

[4] 阿布拉江·克依木，王立举.3-（2-萘基）-1-苯基-吡唑-4-甲醛腙衍生物的简便合成与表征[J].有机化学，2012（32）：2358-2362.

[5] 李 明.甲钴胺的合成研究与缩氨基硫脲及其衍生物的合成[D].银川：宁夏大学，2008.

[6] 邢惟青，黄鹏翔，丘玉昌，等.现代荧光光谱法在药物与蛋白相互作用研究中的应用[J].华西医药杂志，2011，26（5）：503-507.

[7] 孙 洋，樊 君，胡晓云，等.荧光素钠与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究及其分析应用[J].化学学报，2011，69（8）：937-944.

[8] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究抗癌药物羟基喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用[J]药物分析杂志，2010，30（1）：59-62.

[9] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究大豆甙元与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科学学报，2011，27（5）：623-626.

[10] 苏碧泉.芦丁金属配合物与相互作用研究[D].兰州：西北师范大学，2006.

[11] 杨曼曼，席小莉.用荧光猝灭和荧光加强两种理论研究喹诺酮类新药与白蛋白的作用[J].高等化学学报，2006（4）：687-691.

1.2 试验方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA储备液及0.2 mL 0.1 mol/L缓冲液，依次加入不同量的BHP，反应5 min。选择激发波长为280 nm，激发和发射通带均为10 nm。记录300～400 nm的荧光光谱；固定激发和发射波长间隔Δλ分别为20 nm和60 nm，记录同步荧光光谱[6，7]。

2 结果与分析

2.1 荧光敏化光谱

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等残基而发射较强的内源荧光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，改变BHP的浓度时的HSA荧光发射光谱如图1所示。从图1中可以看出，在波长283 nm下，随着BHP浓度的增大，HSA的荧光强度逐渐增强，初步表明BHP具有荧光敏化效应。2.2 BHP与HSA相互作用的敏化机理

许多药物具有荧光，在加入蛋白质后药物的荧光会增强，还有一些药物加入到蛋白质溶液后会使蛋白质荧光增强或有新的荧光峰出现，因此可以利用荧光增强研究蛋白质分子与药物的相互作用[8，9]。荧光增强（敏化）效应主要源于给体-受体间的偶极-偶极作用的能量转移。能量转移的结果为内原发色基团（给体donor）的荧光被猝灭和外源发色基团（受体 acceptor）荧光被敏化。

2.3 敏化常数的确定

根据实验数据及绘制的图形，能很清楚的看到加入药物后荧光强度明显的增强。根据文献[1]的观点，用荧光加强公式来研究药物对蛋白质的猝灭作用也能够得到非常好的结果，尽管两个理论公式的表观形式不同，但所得结果却很接近.这表明两个理论方程的等效性和合理性以及所得结果的可信度，所以也可以用荧光猝灭的公式来研究荧光敏化作用[10，11]。

荧光猝灭光谱法研究化学和生物体系的有效手段是根据Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F0和F分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度，Kq为双分子猝灭速率，τ0是不存在猝灭剂时荧光体的荧光寿命，Ksv是Stem-Volmer猝灭常数。为了阐明其敏化机理，作出温度为20 ℃下HSA与BHP作用的stem-Voliner图（图2）。

从图2中可以看出曲线有良好的线性关系，直线斜率为负值即Ksv为负值，表明不存在药物时HSA的荧光强度比存在药物时的小，进一步证明此药物会使HSA的荧光强度增强，即表现为荧光敏化。由于生物大分子的荧光寿命τ0约为10-8 s，根据Kq=Ksv/τ0，故猝灭速率常数Kq的数量级可以达到1 012 L/（mol·s）。一般认为，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2×l 010 L/（mol·s），显然，Kq也为负值，更进一步证明此药物使HSA的荧光强度增强。

2.4 BHP对HSA构象的影响

同步荧光光谱因具有简化光谱、窄化谱带和减小光谱重叠等优点而常被用于研究药物分子对蛋白质构象的影响。同步荧光光谱可以反应药物分子对蛋白质构象的影响，固定激发波长和发射波长的间距Δλ，同步扫描激发波和发射波即可得到同步荧光光谱（图3、图4）。

蛋白质的荧光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸产生的荧光所共同形成的。在同步扫描过程中，当波长差Δλ=15 nm时，只表现出酪氨酸残基的荧光（图3）；随着药物的加入，最大发射波长有轻微的蓝移，说明由于药物与HSA的作用，酪氨酸残基所处微环境的极性降低，疏水性增强。

当Δλ=60 nm时，主要是色氨酸残基发射的荧光。而色氨酸的最大荧光发射波长与其所处的介质环境有关。从Δλ=60 nm的同步荧光光谱图4中可以看出，色氨酸残基的发射波长有轻微的红移，证明HSA腔内疏水环境的极性增大，疏水性减弱，肽链的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白质构象的变化。

3 小结与讨论

通过荧光光谱法研究BHP与HSA的相互作用，得到了良好的敏化现象。同时研究同步荧光光谱得出BHP使HSA构象发生变化。需要指出的是，用荧光猝灭理论的公式研究荧光敏化是假定给体与受体之间生成了结合物，即在药物低浓度时基本属于加强。研究药物与血清白蛋白的相互作用，有助于从分子水平上了解药物在体内的转运和代谢过程以及进一步阐明药物在人体内的作用机制，药物代谢动力学和蛋白质构象的变化。

参考文献：

[1] 戴 红，赵元飞，牛 平，等.1-{4-[（2-氰基亚胺基-1，3-噻唑烷-3-基）甲基]-噻唑-2-基}-3-取代苯甲酰基脲类化合物的合成及其生物活性[J].有机化学，2013（33）：1568-1572.

[2] 崔胜峰，王 艳，吕 敬，等.噻唑类化合物应用研究新进展[J].中国科学，2012，42（8）：1105-1131.

[3] 王平红.一些金属配合物和DNA相互作用的研究[D].海口：海南大学，2006.

[4] 阿布拉江·克依木，王立举.3-（2-萘基）-1-苯基-吡唑-4-甲醛腙衍生物的简便合成与表征[J].有机化学，2012（32）：2358-2362.

[5] 李 明.甲钴胺的合成研究与缩氨基硫脲及其衍生物的合成[D].银川：宁夏大学，2008.

[6] 邢惟青，黄鹏翔，丘玉昌，等.现代荧光光谱法在药物与蛋白相互作用研究中的应用[J].华西医药杂志，2011，26（5）：503-507.

[7] 孙 洋，樊 君，胡晓云，等.荧光素钠与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱研究及其分析应用[J].化学学报，2011，69（8）：937-944.

[8] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究抗癌药物羟基喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用[J]药物分析杂志，2010，30（1）：59-62.

[9] 尚永辉，李 华，孙家娟，等.荧光光谱法研究大豆甙元与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科学学报，2011，27（5）：623-626.

[10] 苏碧泉.芦丁金属配合物与相互作用研究[D].兰州：西北师范大学，2006.

[11] 杨曼曼，席小莉.用荧光猝灭和荧光加强两种理论研究喹诺酮类新药与白蛋白的作用[J].高等化学学报，2006（4）：687-691.