北京地区儿童急性上呼吸道感染中肠道病毒感染谱的分析

李霖琳，谢正德，刘春艳，相子春，任丽丽，申昆玲，王健伟*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所, 北京 100730；2.首都医科大学附属北京儿童医院 北京市儿科研究所 儿科学国家重点学科省部共建儿科重大疾病研究重点实验室， 北京 100045)

北京地区儿童急性上呼吸道感染中肠道病毒感染谱的分析

李霖琳1，谢正德2，刘春艳2，相子春1，任丽丽1，申昆玲2，王健伟1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所, 北京 100730；2.首都医科大学附属北京儿童医院 北京市儿科研究所 儿科学国家重点学科省部共建儿科重大疾病研究重点实验室， 北京 100045)

目的了解北京地区儿童急性上呼吸道感染中肠道病毒(EV)的感染谱。方法收集2009-05-09于北京儿童医院就诊的急性上呼吸道感染患者的咽拭子1 121份，用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对EV的VP1基因进行了扩增并测序。结果发现55例为EV阳性，分属14个血清型。其中44例属于A种EV(EV-A)，11例为EV-B。检出EV与手足口病及无菌性脑膜炎中检测到的EV具有高度同源性，但和EV原型株相比较均产生了不同程度的变异。结论2009年北京地区急性上吸道感染儿童中以EV-A感染为主，与成人病原谱存在差异。

肠道病毒；呼吸道感染；感染谱

肠道病毒(enteroviruses, EV)是单股正链无包膜的小RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属。人EV分为A、B、C和D 4个种。EV-A包括24个血清型，EV-B包括61个血清型，EV-C包括23个血清型，EV-D包括5个血清型 (www.picornaviridae.com/enterovirus/)。EV可以引起呼吸道感染、无菌性脑膜炎、心肌炎和手足口病等多种疾病。

近年来，EV在呼吸道感染中的作用受到了广泛重视，认为是中国儿童呼吸道感染的重要病原体、夏季呼吸道感染的主要病原体[1-4]。而由于EV的血清型众多，哪些血清型与呼吸道感染相关尚未阐明，国内以往的报道却未对呼吸道感染中检测到的EV进行分型研究。本研究对北京地区儿童上呼吸道感染的临床EV感染样本进行了检测和分型，以进一步了解EV血清型与呼吸道感染间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例来源

2009-05-09首都医科大学附属北京儿童医院门诊临床诊断为急性呼吸道感染的患儿共1 121例，其中男632例，女489例(男∶女=1.3∶1)。年龄分布为1个月～17岁，年龄中位数为38个月。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:采集患者咽拭子，置4 ℃保存，72 h内运至实验室分装，冻存于-70 ℃。

1.2.2 核酸提取:自动核酸提取仪NucliSens easyMAGTM(法国生物梅里埃)进行DNA和RNA提取，保存于-70 ℃。

1.2.3 病毒核酸检测:多重反转录聚合酶链反应(multiplex RT-PCR)进行常见呼吸道病毒核酸检测，包括流感病毒甲、乙、丙型(influenza viruses, IFV A、B、C)、副流感病毒1～4型(parainfluenza virus, PIV 1～4)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、鼻病毒(rhinovirus, HRV)、偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)、腺病毒(adenovirus, AdV)、人冠状病毒(human coronavirus, HCoV)、博卡病毒(human bocavirus, HBoV)和EV。详细检测方法和引物序列见文献[5]。

1.2.4 EV的分型检测:RT-PCR方法扩增EV的VP1区，详细检测方法和引物见文献[6]。对扩增的产物进行T-A克隆后测序。和EV各血清型的原型株进行序列比对，VP1 区核苷酸同源性≥75%或氨基酸同源性≥88%，即认为是同一血清型[7]。

1.2.5 生物信息学分析:BioEdit 7.0.0版本进行多序列比对。Mega4.0软件构建进化树, 采用Kimura 2-parameter模型以邻接法(neighbor-joining), 建树的可靠性由1000 Bootstrap值评估。

2 结果

2.1 EV检出情况

共检测到55例EV阳性的急性上呼吸道感染患儿。其中男32例，女23例(男∶女=1.4∶1)。年龄分布为9个月～10岁，年龄中位数是38个月。除5月份外，EV在筛查的各个月份(6月到9月)均有检出，其中以8月检出率最高，达到10.1%。不同月份检出率见(表1)。

表1 EV在不同月份的检出率Table 1 Detection rate of EV

55例EV阳性的患儿中，12例存在与其他呼吸道病毒共感染的情况。其中1例与hMPV共感染、1例与IFVB共感染、1例与PIV4共感染、1例与HRV共感染、2例与RSV共感染、2例与ADV共感染、3例与PIV3共感染，1例与PIV1和HRV共感染。

2.2 EV的分型

在55例EV阳性的病例中，只检测到A和B两个种。EV-A阳性44例，包括7个血清型；EV-B阳性11例，包括7个血清型(图1)。EV-A阳性病例中柯萨奇病毒(CV)A2和CVA6最多，各有10例；CVA12和CVA5分别为9例和8例；CVA10有4例，CVA8有2例，CVA16有1例。EV-B阳性的病例中CVB2最多，有4例；其次为CVA9，2例；CVB1、 CVB5、埃可病毒(E)6、E19和E25各1例。在检出率最高的8月份， 17例EV阳性分属10个血清型。 EV-A、EV-B各有5个血清型。EV-A阳性病例中CVA2和CVA12最多，各3例；CVA16和CVA5各2例；CVA16有1例。EV-B阳性的病例中CVA9最多，2例；CVB2、 CVB5、E6和E25各1例。

图1 EV的分型检测结果Fig 1 Genotyping of enteroviruses in respiratory samples

2.3 EV临床株的进化分析

和原型株比较，除CVB2的某些临床株外，其余临床株都发生了不同程度的变异(表2)。其中CVA2的某些临床株变异度最大，核苷酸和氨基酸的同源性只有77.5%和87.8%。同一血清型临床株间也有不同程度的变异，临床株间变异最大的CVA2，在进化树上分为3个分支(图2)。另外，检出的EV与在手足口病和无菌性脑膜炎患者样本中EV的同一血清型序列比对发现，它们间具有高度的同源性(核苷酸序列≥96%)，在进化树上处在同一分支上(图2)。

2.4 氨基酸位点的突变分析

和原型株氨基酸比对发现，在VP1的第81位和82位氨基酸存在3种突变模式，导致进化树上呈现3个分支。第81位氨基酸由亮氨酸(L)突变为异亮氨酸(I)后在进化树上独立成为1支；而第81和82位联合突变为异亮氨酸-甘氨酸(IG)或异亮氨酸-丝氨酸(IS)后在进化树上另成1支；这两个氨基酸突变为缬氨酸-丝氨酸(VS)后在进化树上成为第3支(图3)。

▲prototype；●clinical strains detected in this research；■clinical strains detected in hand-foot-mouth disease or aseptic meningitis图2 EV基因组部分VP1基因的进化分析Fig 2 Phylogenetic analysis of the partial VP1 genes of enteroviruses in respiratory samples

3 讨论

EV相关的呼吸道感染夏季高发，所以本研究对2009年5月至9月的儿童上呼吸道感染样本进行了检测，共检测到14个血清型，说明上呼吸道感染中的EV存在多样性。其中EV-A的病例占了EV感染病例的80%(44/55)，与成人EV感染情况不同[8]。成人感染以EV-C中的CVA21和EV-D中的EV68为主要病原， EV-B多于EV-A。但由于样本时间跨度较短，不排除季节因素。

表2 EV各基因型分布及同源性比较Table 2 Serotype distribution and nucleotide homology between prototypes and clinical strains

图3 CVA2的临床株及原型株的氨基酸变化Fig 3 Comparison of amino acids between prototype and clinical strains of CVA2

此次检测到的14个血清型也存在于手足口病和无菌性脑膜炎中[9-11]。进化分析发现同一血清型中不同疾病患者分离的病毒株间具有高度的同源性，在进化树上位于同一进化支上，提示相同的病毒感染可引起多种临床疾病如呼吸道感染、手足口病或无菌性脑膜炎等。

此外，临床株VP1基因序列与原型株比较都有不同程度的变异，CVA2最为明显，在进化树上分为3个分支，其VP1蛋白第81和82位氨基酸的突变成为分支形成的关键。这两个氨基酸在病毒进化中的作用，需要更多数据分析。通过所获得的数据可以看出，CVA2在检测到的EV中所占比例最高，在2012年深圳的手足口患者病原检测中也位居第4位，因此CVA2在儿童中的致病作用应更加值得重视。

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Spectrum analysis of enteroviruses in children with acute respiratory tract infections in Beijing

LI Lin-lin1，XIE Zheng-de2, LIU Chun-yan2, XIANG Zi-chun1, REN Li-li1,SHEN Kun-ling2, WANG Jian-wei1*

(1.Institute of Pathogen Biology, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730; 2.National Key Laboratory of Major Diseases in Children and National Key Discipline of Pediatrics，Ministry of Education，Beijing Pediatric Research Institute，BCH-CMU，Beijing 100045, China)

ObjectiveTo determine the spectrum of enteroviruses (EV) in children with acute respiratory tract infections (ARTI) in Beijing.MethodsThroat swabs were collected from 1,121 children at the time of admission to the Beijing Children’s Hospital for ARTI during May 2009 through September 2009. To detect EV, the viral protein 1 (VP1) gene were amplified by reverse transcription PCR and verified the findings by sequence analysis.ResultsEV was detected in 55 children and 14 EV serotypes were identified. Among of them, 7 EV serotypes including 44 cases belonged to EV-A and the others belonged to EV-B. The sequences of EV in this research had very high homology with that detected in hand-foot-and-mouth disease or aseptic meningitis. Compared to prototype, mutations were happened in clinical strains.ConclusionsEV-A was dominant in children with acute respiratory tract infections which was different to that of the adult in Beijing in 2009.

enteroviruses; respiratory tract infections; spectrum of infection

2013-12-12

2014-01-07

国家科技重大专项“传染病监测技术平台”项目(2012ZX10004-206)

*通信作者(correspondingauthor)： wangjw28@163.com

1001-6325(2014)04-0485-05

研究论文

R 373.2

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