烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略

余婧，张孝廉，赵丹，邹颉，赵杰宏

1 贵州省烟草科学研究院，烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵州 贵阳550081；

2贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，贵州 铜仁 554300；

3 贵州大学贵州省农业生物工程重点实验 室，贵州 贵阳 550025

生物技术

烟草转基因研究常用遗传元件筛查策略

余婧1,2，张孝廉1，赵丹3，邹颉1，赵杰宏1

1 贵州省烟草科学研究院，烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵州 贵阳550081；

2贵州烟叶复烤有限责任公司铜仁复烤厂，贵州 铜仁 554300；

3 贵州大学贵州省农业生物工程重点实验 室，贵州 贵阳 550025

通过检索国 内外近10年烟草转基因研究的相关文献，建立了转基因烟草常用转化遗传元件的数据库，统计了每个遗传元件及组合元件的使用频率后，发现利用7种遗传元件，包括：启动子P-35S、标记基因NPT II、HPT、Bar和aadA、报告基因GUS及终止子T-NOS作为靶标元件组合，能使目前烟草转基因 事件的理论筛 查率达到100%，从而构建出转基因烟草的优化筛查策略。

转基因烟草；遗传元件；转基因筛查

烟草制品作为一种特殊的消费品，其吸食安全性一直是争论的焦点，转基因烟草比其他转基因植物更难获得消费者的认可。转基因烟草不能进行商业化生产，且烟草制品中不能含有转基因成分，烟草转基因研究只能作为一种技术储备[1]。在我国，我们一方面在加大转基因研发力度，另一方面，也在强化对转基因的监管，严控转基因污染[2]。烟草中转基因成分的检测是一个复杂的问题，涉及技术、法律及商业信息，国际上尚无统一的检测标准。

转基因成分检测主要包括基于DNA检测和基于蛋白质检测的方法，其中基于DNA的转基因检测方法应用最为广泛[3]，例如实时荧 光定量聚合酶链式方应（RQ-PCR） 被广泛应用于定量检测食品或饲料中的转基因成份含量[4]。基于DNA的转基因检测方法首先通过对某些遗传元件进行筛查，例如导入的外源表达基因、用于筛选阳性植株的筛选标记基因、以及各种启动子、终止子，挑选出使用频率最高的少数几个遗传元件作为检测靶标，如果检测出其中任何一个元件，表明该样品含有转基因成分，如果未检出，则表明样品中不含有已知转基因成分，不同作物使用的遗传元件种类和频次各不相同，因此不同作物需根据具体情况采用合适的筛查检测策略[5-6]。

目前关于转基因作物遗传元件筛查信息的报道，研究对象多为玉米、大豆、油菜、棉花、水稻等国际上商业化种植的转基因作物[6-8]，而有关转基因烟草遗传元件筛查的文献未见报道，本文根据国内外已发表的有关烟草遗传转化的研究文献，统计部分常用遗传转化元件在烟草遗传转化中出现的频率，以期筛选出烟草转基因检测中理论覆盖率最高的基因元件组合，为烟草转基因检测奠定基础。

1 材料与方法

在中国知网全文期刊数据库（http://www.cnki.net/）输入关键词“转基因烟草”，在google学术搜索（http://scholar.google.com/）输入关键词“transgenic tobacco”，搜索近10年来国内及国外有关转基因烟草的研究情况，对文献所报道的转入烟草的外源基因启动子、终止子和筛选标记基因进行筛查，并统计各单个遗传元件及遗传元件组合在烟草遗传转化研究中的使用频率。

2 结果与分析

2.1 烟草转基因研究中高频使用遗传元件

在我们的筛查中，随机选取近10年来有关烟草转基因研究报道共229篇，根据所收集的信息，目前烟草转基因研究中常用的启动子主要有P-35S，筛选标记基因主要有：NPT II、HPT、Bar，报告基因主要有：GUS、GFP，终止子主要有T-NOS、T-35S、T-OCS。部分转化事例中还使用到单子叶植物遗传转化常用启动子P-Ubi[9-11]，诱导表达或特异性表达启动子Napin[12]、RD29A[13]、PrbcS[14]等启动子约40种，aadA[15]、OFP[16]等筛选、报告基因及Cry1A[17]、OsLS[18]、PtrMAPK[19]等抗虫、抗病、抗旱相关功能基因约200种，共涉及250种以上遗传元件。部分较为常用的遗传元件来源及功能见表1。

表1 烟草遗传转化部分常用遗传元件来源及功能Tab.1 Source and function of common genetic elements in genetic transformation part of tobacco

2.2 转基因烟草研究中单个遗传元件使用频率

所筛查的有关转基因烟草研究的229篇文献中，国内期刊文献166篇，国外期刊文献 63篇。由于涉及文献数量及转化事件较多，我们无法按目前国际上所流行的单个事件单个列出的方式进行矩阵统计[6-8]，于是将搜索到的有关文献按其转化事件的目的进行分类，分为“品质改良”、“生物反应器”、“生态环境效益改良”、“基因功能验证分析”、“其它”五种类型，其中，“基因功能验证分析”分为“启动子功能”、“表达基因功能”两种类型。

以转化事件的分类为列，常用遗传元件为行，统计各遗传元件在转基因烟草研究中的使用频率。统计结果如表2。表达基因启动子P-35S使用频率最高，在国内及国外所报道的文献中，其使用频率分别为65.1%、74.6%，综合使用频率67.7%；表达基因终止子T-NOS使用频率最高，综合使用频率67.7%；筛选标记基因NPT II使用频率最高，综合使用频率63.3%；报告基因GUS使用频率最高，综合使用频率25.8%。

2.3 转基因烟草研究中常用遗传元件组合筛查

从表2可以看出，没有任何单个遗传元件的使用频率达到100%，因此无法用单个元件检测出所有的转基因烟草，为尽最大可能检测到烟草转基因事件，需使用两个元件以 上的组合进行筛查。

我们将使用频率偏高的元件组合后进行筛查，筛查结果列于表3。其中①号组合：P-35S+T-NOS是国际上较为常用的转基因作物筛查组合元件[3,20]，目前批准商业化种植的转基因作物90%以上至少含有这二种元件的一个[21]，在我们的筛 查中，烟草转基因研究中有86.0%的转化事件使用到①号组合中的一个元件，即该组合的理论筛查覆盖率为86.0%；表3中，③号组合：P-35S+T-NOS+NPT II理论筛查覆盖率为90.0%，而CORESTA（Task Force Genetically Modified Tobacco-Detection Methods）[22]、GB/T 24310-2009 《烟草及烟草制品 转基因检测方法》[23]将P-35S、T-NOS、NPT II三种遗传元件作为转基因烟草检测中共有序列标志，可是在该检测中，即使用三个元件同时进行检测，理论上仍然约有10%的烟草转基因污染事件会被漏检。

为最大限度的检测到烟草转基因事件，我们在③号组合的基础上加了GUS、HPT等常用遗传元件组合，尽管⑦号组合：P-35S + T-NOS +NPT II+GUS+Hpt+Bar所选遗传元件均为烟草转基因事件中常使用的基因元件，但经我们筛查，其覆盖率为98.7%，理论上仍有1.3%的烟草转基因事件会被漏检，经过统计发现该漏检元件均为aadA基因，aadA基因所编码的壮观霉素抗性基因是烟草叶绿体转化技术中最常用、最好的筛选标记[24]，在部分烟草叶绿体转基因事件中，该筛选标记基因及表达基因的启动子及终止子均为特异的[15,25-27]，因此，即使使用⑦号组合中的所有元件进行检测，也不能覆盖到该类型的转基因事件，在表2中，尽管所统计的aadA基因的使用频率仅为4.4%，但鉴于该转化事件的特殊性，为不使烟草叶绿体转化事件漏检，最高限度降低转基因事件的漏检 率，综合以上 分析，我们建议以⑨号组合：P-35S + T-NOS +NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA进行筛查，能最大限度检测到转基因事件，该组合涉及7个遗传元件，理论筛查覆盖率为100%。

表2 烟草转基因研究中常用遗传元件使用频率Tab.2 Usage frequency of common genetic elements in transgenic tobacco research

表2（续）

表3 烟草转基因研究中常用遗传元件组合筛查Tab.3 Screening of common combined genetic elements in the study of transgenic tobacco

3 讨论

1983年，首例含有抗生素药类的转基因烟草在美国培育成功[28]，之后的30年间，转基因技术发展十分常迅猛，转基因生物及其产品大量问世[29-30]。烟草作为基因工程研究中使用最为广泛，遗传转化技术最为成熟的模式植物[31-32]，各科研单位遗传转化烟草的目的不仅仅是对其品质进行遗传改良[33]，更多的是将外源基因导入烟草，在转基因烟草中对未知基因进行分析、验证、发掘，或将烟草作为生物反应器生产研制基因工程药物、天然香料及化工原料等[30,32-34]。

随着烟草转基因研发力度的不断加大，国家局为保证我国烟草制品吸食安全性，自2003年，便已下发《国家烟草专卖局关于加强对转基因烟草监控的通知》国烟科〔2003〕387号，对转基因烟草进行监控、检测，严防烟草制品转基因污染。

已有文献报道，随着转基因技术的不断发展，越来越多的转基因案例中采用了全新的启动子、终止子和标记基因，使得现在常用的筛选元件覆盖面减小，失去筛选的意义[20]，因此，对烟草转基因检测而言，有必要对现有转基因事件中所使用的遗传元件进行分析，并根据这些信息再次筛选合适的筛查靶标。本文通过对229篇转基因烟草研究中所用遗传元件进行筛查，最终选定P-35S+T-NOS+NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA这一组合为理想筛查组合，主要考虑以下因素：1）尽管部分烟草转基因事件采用新的遗传元件，但P-35S、T-NOS、NPT II三种元件在遗传转化研究中原理、技术最为成熟，因此，烟草转化事件中使用三种元件其中之一分别作为启动子、终止子或筛选标记基因的频率仍然较高，且它们为国际上较为流行的转基因作物检测靶标序列；2）在以上三种元件组合使用的基础上，加入GUS、HPT、Bar三种遗传元件能增加筛查覆盖频率；3）加入aadA基因能检测到部分烟草叶绿体转化事件，降低漏检风险。

本文首次统计并分析了近10年来国内外文献所报道的烟草转基因事件，建立了烟草转基因研究常用遗传元件数据库，构建P-35S+T-NOS+NPT II+GUS+HPT+Bar+aadA 7种遗传元件的最优筛查组合策略，理论筛查覆盖率为100%，并首次提 出将aadA基因纳入筛查组合，防止部分烟草叶绿体转化事件的漏检。值得提出的是，我们的筛查组合是通过对烟草转基因“已发生事件”的统计而筛选出，就目前而言是可行的，但随着转基因技术的不断进步及发展， 该策略并不意味着对“将来发生事件”的检测能达到100%。

综上，该筛查策略的提出，进一步完善了现有的转基因检测体系，为行业当前烟草转基因的检测提供了筛查依据。

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Screening strategy of genetic elements used in transgenic study

YU Jing1,2,ZHANG Xiaolian1,ZHAO Dan3,ZOU Jie1,ZHAO Jiehong1
1 Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Tobacco Research Institute,Guiyang 550081,Guizhou,China;
2 Guizhou Tongren Tobacco Leaf Redrying Co.,Ltd.,Tongren 554300,Guizhou,China;
3 Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering,Guizhou University,Guiyang 550025,Guizhou,China

A transgenic tobacco database of routine genetic elements was established based on literature review of t ransgenic tobacco research in the last 10 years.Genetic elements that were commonly used in transgenic tobacco research were screened to reveal frequency of individual and combination of genetic elements.A combination of P-35S promoter,NPT II/HPT/Bar/aadA selective marker genes,GUS reporter gene and T-NOS te r minator as screening target elements can make screening rate of transgenic tobacco reach 100% in theory.Thus,an optimized screening s trategy for transgenic tobacco is being laid out.

transgenic tobacco; genetic elements; transgenic screening

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.015

TS413

A

1004-5708（2014）01-0078-06

贵州省科学技术基金“富钾基因发掘及无选择标记转基因烟草培育研究”（黔科合J字[2010]2251）；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“抗TMV富K转基因烟草育种研究”（200910）； 贵州省科技支撑计划农业攻关“转基因烤烟检测标准物质和检测技术研究及应用”（黔科合NY[2013]3020号）

余婧（1983—），女，硕士，农艺师，主要从事烟草转基因检测及烟草生物技术研究，Email:yujingbio@126.com

赵杰宏（1978—），男，博士，副研究员，主要从事烟草生物技术研究，Email:zhaojiehong@126.com

2013-05-30