猪链球菌的分离、16SrRNA鉴定及药敏实验

傅学才

（湖南省娄底市娄星区畜牧水产技术服务中心，湖南娄底417000）

猪链球菌的分离、16SrRNA鉴定及药敏实验

傅学才

（湖南省娄底市娄星区畜牧水产技术服务中心，湖南娄底417000）

从湖南娄底某猪场病猪组织中分离出6株细菌，通过培养特性、细菌染色镜检、16sRNA基因扩增及序列BLAST分析等系统鉴定，确定为猪链球菌。并对分离菌与GenBank中收录的17株猪链球菌的16SrRNA基因序列的进行同源性比对，结果显示,6株分离菌的16SrRNA基因序列与收录菌株同源性为99%以上。药物敏感试验表明，分离细菌对头孢类、β内酰胺类药物高度敏感、对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类药物产生耐药。而6株分离细菌对氯霉素类药物的敏感，但敏感性有差异。

猪链球菌，16SrRNA基因，药物敏感实验

猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病，可致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎。临床表现为急性出血性败血症、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等，可致生猪死亡，危害较严重。据报道血清型众多，目前有35个血清型，而且变异频繁。笔者在湖南娄底某猪场剖检了疑是猪链球菌病的生猪2头，从采集的组织样中分离出6株细菌，通过细菌形态学、16SrRNA等系统鉴定，确定为猪链球菌。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湖南省娄底的两个猪场采集的三元仔猪2头和6份病料。鲜血琼脂、巧克力琼脂购自江门市凯林贸易有限公司。即用型PCR Mix试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，药敏纸片分别购自上杭州微生物试剂公司

1.2 细菌分离

将采集的组织病料在超净工作台内接种于鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基，于37℃培养24 h，观察细菌菌落形态特征，挑取疑是猪链球菌的菌落进行纯培养。

1.3 细菌染色镜检

挑取疑是猪链球菌纯培养菌落涂片，进行革兰氏染色、显微镜下镜检，观察细菌形态特征。

1.4 细菌PCR检测和测序

1.4.1 细菌基因组DNA的提取

用煮沸方法提取细菌DNA模板，离心过夜培养菌液，加入150μLTE缓冲液混均后，沸水中煮沸10min，冰浴后离心取上清夜做PCR反应的模板。

1.4.2 对分离菌进行PCR鉴定

按Makino S的方法设计猪链球菌16SrRNA（M23728）PCR引物。上游引物P1：

5’-ACGCGTAGGTAACCTGCCTC-3’，下游引物 P2：5’-GCCATTGTAGCACGTGTGT-3’。 扩增片段理论长度为1130bp。反应体系（50μL）：10×Taq bufer 5.0μL，dNTPs（2 mmol／L）5.0μL，MgCl2（20mmol／L）3.0μL，上下游引物（20 p mol／μL）各 2.0μL，Taq DNA聚合酶（2 U/μL）1.5μL，模板2.5μL，灭菌双蒸水29.0μL。反应程序：94℃预变性 2 min；94℃ 1min，56℃ 2min，72℃ 2 min，30 个循环；72℃延伸7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统下观察结果。

1.4.3 测序

PCR产物送上海生工测序，测序结果进行BLAST比对。

1.5 药敏试验

选择鉴定猪链球菌的菌株培养液涂布接种于鲜血琼脂平板，在无菌操作条件先将将药敏试纸片平贴于培养基表面，37℃培养箱培养24 h，测量其抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌特性

2.1.1 从采集的病猪组织样品中分离到13株细菌，其中6株出现α溶血现象。

2.1.2 6株出现α溶血现象细菌染色镜检为呈链状排列的革兰氏阳性球菌（见图1）。

2.2 PCR鉴定

分离菌株的PCR扩增产物为1130 bp大小的片段，与预期目的片段相符（见图2）。

2.3 同源性比对

对分离菌采用16S rRNA的引物对其可变区基因进行克隆、测序和同源性比对,并用BLAST软件分析其同源性。结果表明,此6株菌株通过同源性比对,与GenBank数据库中收录的17株链球菌的16SrRNA基因序列同源性均大于99%,16SrRNA基因进行PCR扩增（图3）。

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2.4 药敏试验

分离菌株对头孢头孢噻肟、先锋霉素、青霉素高度敏感，对复方新诺明、链霉素、强力霉素、阿奇霉素耐药，对氨苄西林、恩诺沙星、氟苯尼考的敏感性6株菌有差异。结果见表1。

2.5 疾病控制

采取栏舍彻底消毒，发病猪隔离。青霉素或头孢喹肟配合治疗，治疗期间饲料中添加一定量的复合多维和黄芪多糖，有效地控制了疫情，没有发生人的感染病例。

3 讨论

实验结果表明，在分离菌落的基础上，采用细菌16SrRNA基因可初步鉴定猪链球菌，而且可以拨开链球菌多样性的干扰，准确度高。但分型和致病性还要进行血清学分型试验和毒力测定，进一步用小白鼠实验和动物回归实验佐证。

对6株分离菌进行药敏试验，结果表明该分离菌对头孢类和β内酰胺类高度敏感，与相关文献报道猪链球菌药敏结果不一致，这可能与不同猪场药物的耐药性有关，因此，对于细菌病的治疗最好在药敏试验基础上合理用药。预防和保健时尽量少用和避免长期使用同一种药物。□

[1]陆承平.兽医微生物学（第三版）[M].北京:中国农业出版社,2001:301-307.

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S858.28

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1006-4907（2014）03-0021-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.010

2014-05-10