不同品种（系）烤烟西柏三烯二醇代谢差异研究

王冬，孙九哲，彭玉富，张小全，李丽华，宋洋洋，杨铁钊

1河南农业大学，烟草学院，郑州市文化路95号 450002；

2河南中烟工业公司，技术中心，郑州市陇海东路72号 450002

农艺与调制

不同品种（系）烤烟西柏三烯二醇代谢差异研究

王冬1，孙九哲2，彭玉富2，张小全1，李丽华1，宋洋洋1，杨铁钊1

1河南农业大学，烟草学院，郑州市文化路95号 450002；

2河南中烟工业公司，技术中心，郑州市陇海东路72号 450002

为阐明烟草西柏三烯二醇代谢机理，采用GC-MS测定了8306、12451、云烟87、Y892×8306、豫烟11号、NX232和中烟100，7个烤烟品种（系）中部叶龄60 d叶面分泌物组分，并对其中具有代表性的4个材料的西柏三烯二醇合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16进行了荧光定量PCR测定，对生育期叶面分泌物的变化、调制后烟叶茄酮含量和感官质量进行了分析评价。结果表明，7个烤烟品种（系）中部叶叶龄60 d时烟叶的叶面分泌物中，共测定出13种非挥发性化合物，主要成分为西柏三烯二醇；8306具有最高的叶面分泌物和西柏三烯二醇含量，豫烟11号次之，12451最低；CYC-1和CYP71D16在8306中的相对表达量显著高于12451和云烟87，初步说明这两个基因的上调表达促进了西柏三烯二醇的合成。成熟期具有较大西柏三烯二醇降解量的8306和豫烟11号在调制后拥有更高的茄酮含量。

烤烟；叶面分泌物；西柏三烯二醇；茄酮；品种

烟草叶面分泌物与香气关系密切。有研究人员曾对成熟期烤烟进行叶面分泌物的浸提，发现叶面分泌物的缺失对烤烟香味成分和感官质量均产生了负面影响[1]。烟叶的某些特征香气来源于叶面分泌物及其降解产物或衍生物，是构成烟叶品质的重要组成部分，而且能充分体现出品种的差异性[2-4]。因此，叶面分泌物研究对提高烤烟品质和促进烟草品质育种均具有重要意义。烟草叶面分泌物是烟草香味和香气组分的重要前体物，某些品种叶面分泌物可占烟叶干重的10%[5]。几类主要的叶面分泌物成分是：类西柏烷和类赖百当二萜、糖酯、表面蜡以及一些微量成分（包括挥发性物质、N-羟酰基降烟碱、西柏烯和一些金属元素等）[6]。对于烤烟来说，西柏三烯二醇是烟叶叶面分泌物的主要成分，能占到分泌物总量60%左右[7]，并在调制后大部分降解产生茄酮及其衍生物等多种香味成分[8]。在烟草中，西柏三烯二醇的合成反应大致分为两步：首先在西柏三烯醇环化酶的作用下，香叶基香叶基焦磷酸发生环化反应，形成西柏三烯一醇[9]；然后经过细胞色素P450羟化酶的作用，西柏三烯一醇的第6位碳发生羟化反应形成西柏三烯二醇[10]。

目前，编码西柏三烯醇环化酶（CYC-1，Genebank Accession No.AY049090）[7]和编码细胞色素P450羟化酶（CYP71D16，GenBank Accession No.AF166332）[10]的基因已经相继得到了确定。研究表明，影响烟叶表面分泌物特点的因素有很多，包括烟草生长所处的水肥条件等[11]，但其最主要影响因素是烟草的遗传构成[1,12-13]。

近年来，对烟叶表面分泌物已有不少研究，但多数仍停留在品种间对比、影响因素和调控措施上，对叶面分泌物代谢过程中的关键基因以及调制后相关代谢产物的变化方面的研究目前还不多见。本研究从改良烟草叶面分泌物入手，通过对代谢过程关键基因表达情况的测定，初步阐明了造成品种（系）间叶面分泌物含量差异的原因，并结合烟叶成熟后叶面分泌物的降解情况和感官评价结果，探讨了不同品种（系）烤烟成熟过程中烟叶表面香气物质的变化规律，以期为烟草品质育种工作提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料及设计

供试材料为8306、12451、云烟87、Y892×8306、豫烟11号、NX232和中烟100共7个品种（系）。试验于2012年在河南省禹州市进行，5月2日移栽，采用常规施肥手段和田间管理措施。选定具有代表性的植株，自下而上标记1～22位可收叶，挂牌标记，并调查各品种中部叶（第10、11、12位）叶龄（叶片生长至2～3 cm长度时开始计算叶龄）。各品种在中部叶叶龄60d时和成熟采收时（同时期保留杀青样）取样2片，样品遮光干冰保存运送到实验室测量叶面积后进行RNA提取和叶面分泌物的提取；田间烟叶成熟采烤后取具代表性等级（B2F和C3F）烤后烟叶备测。

1.2 烟叶叶面分泌物组分的测定

烟叶叶面分泌物采用美国Thermo Fisher Scientific公司的TRAVE GC ULTRA–DSQ ⅡMS型气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪进行定性定量测定。

叶面分泌物的提取和浓缩：将1000 mL左右二氯甲烷倒入金属托盘（清洁无水残留）中，用镊子夹住叶柄基部将叶片整片浸入二氯甲烷溶液中2秒钟，将叶片提出溶液2秒，使叶片上的二氯甲烷滴回到盘中，这样算作浸提一次，每片叶片反复浸提4次，最后一次浸提后需要将叶片上的二氯甲烷完全滴回盘中。

将托盘中所有的二氯甲烷转移到2000 mL的烧杯中，向烧杯中加入1 mL的内标（内标为1.01 g蔗糖八乙酸酯和1.271 g正-17-烷醇，定容500 mL），充分混匀，加入10 g左右无水硫酸钠，充分搅拌吸去水分，用定量滤纸过滤至1000 mL圆底烧瓶中，滤液减压旋转蒸发至20 mL左右，最后定容至50 mL容量瓶。

用移液管取5 mL上述浸提液于色谱瓶中，在氮气保护下将溶剂吹干。加入500 μL 1:1 (v:v)DMF:BSTFA，在75℃水浴中进行衍生化反应60 min，加入0.5 mL的二氯甲烷溶解不溶物，即为GC/MS分析样品液。

气质联用仪反应条件：GC条件：色谱柱：DB-5MSUI石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度：250℃；程序升温：40℃保持2 min ,然后以6℃/min升温至180℃保持2min,以2℃/min升温至280℃保持20 min；载气：高纯氦气，载气流速：恒流0.8 mL/min；进样量：1.0 μL，分流比：15:1；MS条件：传输线温度：250℃；EI离子源温度：280℃；电离能量：70 eV；质量数范围50-650 amu；检索谱库：NIST08。

1.3 荧光定量PCR

以烟草Actin基因（Genebank Accession No.AB158612）为内参，引物序列为Actin-F:5’GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3’，Actin-R: 5’-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3’；CYC-1（Genebank Accession No.AY049090）引物为F:5’-CGAGGGTGGGATCAAGGAAATACA-3’，R:5’-ATCGCATCCGTGAAAAGCATAAG-3’；CYP17D16（GenBank Accession No.AF166332）引物为F:5’-ATGGACCAATTATGCACCTTCAACT-3’，R:5’-GGCACTGAGCAATTCCAAGAGACA-3’。进行荧光定量PCR测定，反应体系与程序设置见表1和表2。采用Prizm4统计分析软件进行数据统计分析。

表1 荧光定量PCR体系配置（20 μL体系）Table 1 System configuration of Real-Time PCR (20 μL system)

表2 PCR反应程序设置Table 2 PCR reaction procedure

2 结果与分析

2.1 叶面分泌物含量生育期变化趋势分析

由图1可以看出，各材料中部叶叶面分泌物含量在生育期呈双峰线变化趋势，在叶龄30 d时达到第一个峰值，40 d时又有所降低，然后逐渐升高至60 d达到最高峰值，此时材料间差异也最明显，进入成熟期叶面分泌物含量逐渐下降。就材料间来看，8306腺毛分泌物总量在整个生育期始终高于其它材料，云烟87和12451在各叶龄期腺毛分泌物含量均处于较低水平， 当烟叶进入成熟期时，各参试材料叶面分泌物含量差异有逐渐缩小的趋势。

图1 不同叶龄烟叶腺毛分泌物总量Fig.1 Variations in trichome exudates content in tobacco leaves with leaf age

2.2 中部叶叶龄60 d叶面分泌物组分分析

由于各材料叶面分泌物含量在叶龄60 d时差异最明显，因此对叶龄60 d时各品种（系）叶面分泌物进行了GC-MS检测分析，结果如表3所示。

表3 各品种（系）烤烟中部叶叶龄60 d叶面分泌物组分含量Table 3 GC-MS analysis of the trichome exudates components (60 days)

续表3

通过对各品种（系）中部叶叶龄60 d时叶面分泌物的测定，共检测出13种化合物，包括西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及其同分异构体、烷烃类、蔗糖酯、酚类、其它醇类以及叶面浸出的烟碱。可以看出，西柏三烯二醇是这7个烤烟品种（系）叶面分泌物的主要成分，分别占叶面分泌物总量的41.49 %～81.09 %。因此，西柏三烯二醇为叶面分泌物中最主要的香味物质，在叶面化合物对烟叶香味的贡献中起决定性作用；而其它检测出的化合物种均不是叶面分泌物的主要成分，但这些含量较少的化合物共同作用构成了不同烤烟品种（系）间特殊的香味风格。其中，由GC-MS检测出的烟碱为烟叶叶面浸出的部分物质，不能表现烟叶内部烟碱含量的真实情况。从品种（系）间来看，8306具有最高的叶面分泌物总量，其次是豫烟11号，12451最低，而西柏三烯二醇含量也符合这一规律，8306的西柏三烯二醇含量高达67.53 μg·cm-2，豫烟11号为 54.58 μg·cm-2，而 12451 和云烟 87还不足8306的一半；烷烃类物质豫烟11号最高，云烟87次之，Y892×8306最低；蔗糖酯含量是8306最高，而豫烟11号最低。

2.3 CYC-1与CYP71D16基因相对表达量的品种（系）间差异分析

分别选取西柏三烯二醇含量最高和最低的8306和12451，以及常规品种云烟87和豫烟11号共4个材料进行CYC-1和CYP71D16的荧光定量PCR测定，结果见图2。可以看出，CYC-1和CYP71D16在不同品种（系）烟草中表达量差异显著，8306和豫烟11号中CYC-1和CYP71D16的表达量显著高于12451和云烟87。这样的结果进一步证明了烟草叶面分泌物中的主要成分西柏三烯二醇的形成与这两个基因的表达情况密切相关，CYC-1和CYP71D16的上调表达是造成8306和豫烟11号的西柏三烯二醇含量较高的主要原因。

图2 叶龄60 d时CYC-1、CYP71D16相对表达量Fig.2 Relative expressions of CYC-1 and CYP71D16 at the leaf age of 60 days

2.4 成熟期品种（系）间西柏三烯二醇降解差异分析

西柏三烯二醇的降解产物是烟草中含量最丰富的中性香味物质茄酮的来源。因此，继续监测各参试材料成熟采收时期鲜叶叶面分泌物，并将两次取样中西柏三烯二醇含量进行作图比较（图3）；同时测定了叶龄60 d时和调制后烟叶中的茄酮含量（图4）。

图3 各品种（系）于叶龄60d时和成熟期西柏三烯二醇含量Fig.3 The content of CBT-diols at leafage of 60 days and mature period

根据检测结果，相比于叶龄60 d，各品种（系）成熟期西柏三烯二醇含量均有所下降。与叶龄60 d时较大的含量差异不同，成熟后各品种（系）西柏三烯二醇含量相对接近，8306、12451、云烟87、豫烟11号、NX232和中烟100成熟期较叶龄60 d时西柏三烯二醇含量分别减少了66.25 %、16.95 %、18.63 %、57.40 %、33.79 %和19.28 %。其中，8306和豫烟11号在成熟过程中西柏三烯二醇降解量均超过50 %，明显高于其它材料；而12451、云烟87和中烟100西柏三烯二醇降解量相对较低。

对烟叶中茄酮含量的测定结果（图4）验证了上述结论，不同品种（系）烟叶的西柏三烯二醇在成熟和调制过程中的生理代谢存在差异。叶龄60 d时，各材料烟叶茄酮含量接近，而调制后8306和豫烟11号的初烤烟叶中茄酮含量明显高于其它品种（系）。这说明，大量的西柏三烯二醇在烟叶成熟后降解成为对香气质量有重大贡献的茄酮，在这个过程中8306和豫烟11号的西柏三烯二醇得到了更加充分的降解，具有更高的西柏三烯二醇降解能力；而降解量较少的12451和云烟87调制后烟叶中茄酮含量较低。

图4 各品种（系）中部叶叶龄60d与调制后茄酮含量Fig.4 The content of solanone at leafage of 60 days and after flue-cured

2.5 感官质量评价

委托河南中烟对8306、12451、云烟87和豫烟11号这4个材料的中上部初烤烟叶进行了感官质量评价，结果见表4。

表4 初烤烟叶感官质量评分Table 4 Scores of sensory quality

可以看出，豫烟11号感官评吸总分最高，8306和云烟87次之，12451得分最低。其中8306香气质较好、香气量较足、烟气浓度较足，但与其它品种（系）相比余味稍差、较重、刺激性较大；12451除香气质得分较高之外，各项指标均表现一般；云烟87香气饱满、烟气平淡，上部叶杂气较重；豫烟11号香气质较好、香气量较足、香味特殊，无明显缺点。

3 讨论

Severson等[11]已全面地综述了烟叶表面化学及表征各种成分性质的方法，并认为主要的几类鲜烟叶表面非挥发性化合物是：类西柏烷和类赖百当二萜、蔗糖酯和表面蜡。目前得到大多数学者确认的对烟叶香味具有贡献的重要化合物主要是类西柏烷类中的α-和β-西柏三烯二醇和赖百当类化合物中的冷杉醇、赖百当烯二醇等，而且西柏烷类和赖百当类二萜的含量通常位居最丰富的3类主要烟叶表面化合物之首[6,11,12]。其中赖百当类化合物为香料烟所独有，是产生香料烟特征香气的关键成分之一[12,14,15]。在本研究的7个烤烟品种（系）的叶面分泌物中，含量最高的非挥发成分均为西柏三烯二醇，而香料烟特有赖百当类物质则未被检测出，这与前人的研究结果是基本一致的。与此同时本研究尚有少量未鉴定的成分，其中是否还存在未知的特征香气成分，有待进一步研究。

杨铁钊等[16]研究表明，生长过程中单位面积叶面的分泌物量呈双峰曲线变化态势，中部位叶面分泌物量在叶龄60 d时达到最大值，之后直至烟叶成熟，腺毛分泌物含量呈逐渐下降趋势，而叶龄60 d时品种间差异也最大，是测定叶面分泌物量的最佳时期。本研究验证了这一结论。参试的7个烟草品种（系）中，豫烟11号是课题组以MSK326为母本，以高香气烤烟品系8306为父本杂交选育的烤烟杂交种；其父本8306是从烟草腺毛分泌物入手，把提高烟叶表面致香物质含量作为培育高香气品种的一个突破口，培育出的高香气烤烟新品系；试验材料12451来自纯合高香气烤烟品系8306的干燥种子，于2008年搭载中国发射的返回式卫星太空飞行15 d，种子返回地面后经系统选育4代而成突变品系。在遗传背景一致的情况下，经过太空变异，12451中部叶叶龄60d时的西柏三烯二醇含量比原始种8306有大幅度降低，甚至低于常规品种的水平。对比两者西柏三烯二醇合成关键基因的相对表达量，8306的CYC-1和CYP71D16两个基因的表达量显著高于同遗传背景的12451，也显著高于常规品种云烟87。这一结果说明烟草西柏三烯二醇的合成直接受CYC-1和CYP71D16两个基因表达情况的影响，造成8306西柏三烯二醇含量较高的原因是这两个基因的显著上调表达。

目前国内外关于烟叶中西柏三烯二醇的生物降解途径的研究比较少，而得到众多学者公认的降解产物主要成分是茄酮，在酶解或加热等条件下，西柏三烯二醇降解，在键的断裂过程中，得到了茄酮[8,17]。茄酮是烟草中的关键致香化合物，具有类似胡萝卜的香味和甘草、茶样芳香，经烟草的调制、陈化进一步降解后可产生对卷烟吃味有重要影响的茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等物质，其中降茄二酮具有弱的坚果香及甜香，在卷烟中可以明显增加似可可和白肋烟一样的香味[18]。在本研究中，相比于叶龄60 d时，各参试材料在成熟期西柏三烯二醇含量均有所降低，而8306和豫烟11号降解量明显大于其它材料。在调制后，8306与豫烟11号也具有明显较高的茄酮含量，这说明8306和豫烟11号在大田生长期积累的大量西柏三烯二醇更加充分地降解成茄酮。

关于茄酮含量对烟叶香气质量的影响，目前研究结论不一，有研究表明，茄酮含量与烟叶吸食品质呈负相关[19]，如李富强等[20]研究发现，巴西、津巴布韦等进口优质烟叶的茄酮含量均显著低于国内烤烟；然而也有与此相反的研究结论，如邵岩等[21]研究发现，云南上部烟叶的茄酮含量高于津巴布韦，而中部和下部烟叶的茄酮含量则明显低于津巴布韦。由此可见，茄酮与烟叶质量的关系比较复杂，可能不符合简单的直线相关关系。除此之外，茄酮还有可能受诸如基因型、生态条件[22]、烘烤工艺[23]等多种因素的影响，而且还有很多其它因素如生态条件和品种的适应性等均可能影响烟叶感官质量。因此，尽管在本研究中豫烟11号获得了较高的评吸分数，但是不能据此断定这一结果是由较高的茄酮含量所造成的，这一问题还有待于进一步深入研究。

烟叶表面分泌物的代谢受到多种因素的影响[24-25]。本次试验只是探讨了在河南烟区一定条件下部分烤烟品种叶面分泌物的组成以及主要成分的代谢情况，今后可以扩大研究范围，讨论在不同环境条件和栽培措施的影响下，烟草叶面分泌物的代谢变化及其对烟叶质量的影响。利用烟叶腺毛分泌物筛选和鉴定新的高香气烟草种质资源，可以为烟草新品种的选育创造更多新型的特色烟材料，丰富卷烟工业的原料组成。

4 结论

烟草中部叶叶面分泌物含量在生育期呈双峰线变化趋势，叶龄60 d达到最高峰值，此时材料间差异最明显；西柏三烯二醇是烟草叶面分泌物的主要成分；8306和豫烟11号叶面分泌物尤其是西柏三烯二醇含量明显高于其他品种（系）；CYC-1和CYP71D16基因的表达情况与西柏三烯二醇的合成关系密切，其上调表达能够促进西柏三烯二醇合成；烟叶成熟收烤后，西柏三烯二醇进一步降解为茄酮及其衍生物，对烟叶香气质量有重要贡献。

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Metabolism differences of cembratrien-diols in different tobacco cultivars

WANG Dong1,Sun Jiuzhe2,PENG Yufu2,ZHANG Xiaoquan1,LI Lihua1,SONG Yangyang1,YANG Tiezhao1
1 College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China；
2 Technology Center,China Tobacco Henan Industrial Corporation,Zhengzhou,450000,China

Compositions of leaf surface exudates of different tobacco varieties and changes of cembratrien-diols were studied,sensory quality of flue-cured tobacco leaves was also evaluated in order to provide an effective method of finding new tobacco species resources with special aroma.Surface exudates compositions in 60-day-age and mature stage cutters of 7 tobacco varieties,namely 8306,12451,Yunyan87,Y892×8306,Yuyan No.11,NX232 and Zhongyan100 were determined with GC-MS method.Expression level of CYC-1 and CYP71D16,solanone content and sensory quality in flue-cured tobacco leaves was analyzed.Results showed that 13 flavor substances in compositions of leaf surface exudates in 60-day-age cutters of the 7 tobacco varieties were detected with cembratriene-diols being the main substance.The content of cembratriene-diols,being the main flavor composition,varied among varieties with the highest content in 8306 at 60 days after leaf sprouting,followed by Yuyan No.11 and 12451.Expression level of CYC-1 and CYP71D16 in 8306 was significantly higher than that in 12451 and Yunyan87 while8306 and Yuyan No.11 had higher content of solanone.

flue-cured tobacco; leaf surface exudates; cembratriene-diols; solanone; varieties

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.010

S572.01 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）06-0063-07

本研究由中国烟草总公司科技重点项目（110201002008）

王冬（1985—），博士研究生，主要从事烟草遗传育种研究,Email: wangdong0629@163.com

杨铁钊（1955—），教授，博士生导师，主要从事烟草遗传育种研究，Email: yangtiezhao@126.com

2013-11-27