一种新型神经干细胞脉冲加载生物反应器的研制

孙圣凯，陈旭义，汤锋武，张西正，李瑞欣，郭 勇，侍才洪，程 韬

0 引言

神经干细胞的发现和研究为神经再生这一难题提供了新的契机。目前，关于神经干细胞的增殖与定向分化中存在着如分化细胞不能够获得成熟神经元的全部特征、分化存活率低及分化不确定等问题[1-2]。总结当前力学载荷对神经干细胞的影响，从胚胎发育学及神经干细胞生长的微环境角度考虑，我们认为脉冲载荷可能是影响神经干细胞生长、发育、增殖、迁移及分化的合适力学环境，可能诱导出相对成熟的神经元样细胞，并影响其有序排列及定向迁移。本课题组设计并建立了一套新型的动态脉冲载荷与灌流生物反应器系统。该生物反应器能模拟体内生物学及力学环境，对培养神经干细胞进行稳定及可靠的脉冲载荷及应变刺激，为动态培养环境下神经干细胞迁移、定向诱导、分化及力学生物学机理研究提供了一种可靠的平台。

1 材料与方法

1．1 动态监测侧脑室颅内压变化及生化指标

选取武警后勤学院附属医院神经科重症监护病房（Neuro-ICU）在2010年6月至2011年6月期间收治的蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）Hunt-hess分级Ⅰ～Ⅲ患者36例。在积极治疗原发病的基础上，均予以急诊行锥颅侧脑室额角穿刺术。具体方法为：患者剃发，消毒，铺无菌巾，取鼻根正中间向上12～13 cm，旁开2.5～3.5 cm为穿刺点（如图1所示）。右手持针，针尖与皮肤垂直，向同侧外眦角方向直刺约4～5 cm，拔出针芯，如有脑脊液流出，连接RAUMDIC双腔脑室引流装置（内径1.8mm的内腔管，外径2mm，德国罗牌）。术后予以持续脑室外引流及颅内压监护，引流管保留时间为5～7 d。分别于脑室引流术后 1、3、5、7 d 送检脑脊液，比较脑脊液细胞及生化指标。

图1 侧脑室穿刺示意图

1.2 动态载荷与脉冲生物反应器系统的设计

1．2．1 脉冲力学加载装置结构

脉冲力学加载装置包括电动机动力系统、细胞加载系统和计算机控制系统。细胞力学加载生物反应器在单片机程序及电路控制系统调控下可以对培养皿内的细胞进行生物学培养，同时又可以对细胞施加一定参数的脉冲力学载荷。其结构如图2所示。步进电动机通过行程连杆能够进行一定程序控制下的正转和反转，带动移动夹持块作往复运动，通过注射器传递液体压力，进而对培养在生物半透膜上的神经细胞形成液压冲击（如图3所示）；培养皿内设置压力传感器及血气分析探头，监测培养皿内生物学指标（如温度、pO2、pCO2及pH值）及液压传递变化。数据采集与计算机相连，进行实时调控。

图2 细胞脉冲力学加载装置结构图

图3 细胞脉压加载示意图

1．2．2 电路控制与动力系统的设计及工作原理

步进电动机为42BYG001（江苏金坛市四海电机厂），分辨率为 0.6°/步，控制精度为 0.001 25mm，螺距为0.5mm，实际误差控制为±50με。驱动器采用SH-4012伺服器，其与步进电动机连接，通过计算机EPP进行连接后构成动力加载系统。通过编码的单片机控制系统调控步进电动机，彩色液晶可视频显示载荷参数并实时控制单片机程序。具体程序设计原理如图4所示。

1．3 生物反应器运行测试

以下对生物反应器的稳定性、可靠性及精确度进行验证，并对培养系统的密闭性、无菌性及生物学环境进行测量。将细胞培养仓置于含5%（体积分数）CO2、37℃恒温培养箱内，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液100mL；以5、10及20mL/min的流速实施循环灌流；通过控制系统或液晶屏可输入载荷频率、加载时间、实现波形等参数，实时观察并记录各种实验数据，纠正并调整与理论数据的偏差。每天抽取5mL培养液作细菌培养，行二氧化碳、氧分压、pH值及生化指标测量，连续运转15 d。

图4 应变拉伸装置控制系统程序结构图

1.4 生物半透膜生物相容性、力学性能及应变测量

1.4.1 生物半透膜生物相容性测试

根据 GB/T 16886.5—2003/ISO 10993-5：199《体外细胞毒性试验》标准，从持续搅拌的神经干细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入与浸提液接触的生物半透膜，轻轻转动培养器皿，使细胞均匀地分散在生物半透膜表面。选择含5%（体积分数）CO2的空气作为缓冲系统，在（37±2）℃温度下进行培养，用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。

1.4.2 生物半透膜力学性能及应变测量

采用硅胶膜（Sylgard 184 kit，USA），自制尺寸：半径20mm，厚0.3mm。室温固化7 d后，采用Instron5865材料测量仪进行拉伸实验。拉伸参数设定为：拉伸长度 50mm，拉伸应变 3%（3 000με），拉伸速度4.2mm/s，最大拉伸位移0.21 cm，频率0.5 Hz，拉伸次数100次。采用Ansys软件进行仿真模拟分析，并构建数据模型，有限元模型共计26 322×4=105 288单元，压力：1、3、7 kPa。采用超弹性单元HYPER58，弹性模量 1.0～17MPa，泊松比 0.45。

1．5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示；正态分布数据采用重复测量方差分析，LSD-t检验方法用于组间多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 侧脑室颅内压变化及脑脊液生理指标

SAH Hunt-hess分级Ⅰ～Ⅲ患者的颅内压波动在5～20mmHg（1mmHg=133.322 Pa），呈半正弦波，频率为 0.5～2Hz。脑脊液生化：葡萄糖 2.2～3.9mmol/L，蛋白质120～600 mg/L，K+（2.73±0.82）mmol/L，Na+（137.7±8.9）mmol/L，Cl-（119.0±10.1）mmol/L。

2．2 设计结果

我们成功研制出在电路控制系统调控下的动态载荷与脉冲灌流生物反应器系统，该装置可以在培养皿内对细胞进行生物学培养及诱导，还可以对细胞施加一定的脉冲式力学载荷。实物图如图5、6所示。

图5 细胞脉冲力学加载装置实物图

图6 细胞脉冲力学加载装置电路控制系统

2．3 生物反应器运行测试

反应器连续运行15 d，所提取培养基均无细菌生长。加载装置能准确按上位控制指令运行，指令工作时间和频率与实际相符，位移偏差为（0.5～8）×10-3mm。在空载运行的基础上，指令参数设为0.5Hz、2周、施加应变3%，结果显示：加载生物反应器噪音小、摩擦力小，连接及夹持部位稳定，电动机运行及升温稳定，硅胶膜弹性良好。控制系统稳定，无数据紊乱、程序跑飞和暂停现象，液晶显示屏显示正常，与实际运行相符。

2．4 生物半透膜生物相容性、力学性能及应变测量

2.4.1 生物相容性测量

采用普通聚赖氨酸包被培养器皿和硅胶膜培养神经干细胞，培养5 d后显微镜检查显示培养细胞的近汇合和形态情况如图7所示。

图7 nestin免疫荧光染色见阳性克隆球

2.4.2 力学性能及应变测量

拉伸应变在0～3%的范围内，即随着载荷量的增加，拉伸应变也随之增加，而且这种变化具有良好的量化关系，如图8所示。硅胶膜中间部分应变较均匀，最大应变为0.082，中间部分为0.024～0.028。

3 讨论

在哺乳动物中枢神经系统的发育过程中，神经元细胞的精确迁移和准确分化是神经系统功能正常实现的基础。研究表明，在中枢神经系统中，神经干细胞存在于机体的特定区域中，而成体哺乳动物脑内主要集中于2个区域，即侧脑室壁的室下区和海马齿状回的颗粒下区[3-4]。被神经干细胞占据的区域内存在了大量的血管内皮细胞，这些内皮细胞从生物学上调控了神经干细胞的增殖分化，并且使细胞始终处于一个相对密闭，又不断地受脉压作用的力学环境中[5]。力学刺激伴随着神经组织的生长、发育、功能形成乃至死亡。目前，已证实力学环境对细胞增殖、分化及成熟过程具有十分重要的作用[6-9]。因此，力学刺激等物理因素对神经干细胞向神经细胞分化和迁移及细胞间相互作用很可能产生重要的影响。

由于神经干细胞受力的多样性，研究不同力的作用对神经干细胞的定向分化是十分复杂的问题[10]。神经干细胞具有独特而复杂的结构与力学环境，包括液体压力、流体剪应力、拉伸力等，因此，在动态监测人侧脑室颅内压的基础上，我们认为脉冲力学载荷是一个相对宏观、综合的载荷指标，有可能是促进神经干细胞向神经元样细胞分化的重要因素。

图8 硅胶培养细胞面应变与硅胶背面应变

该神经干细胞脉冲加载生物反应器能较好地模拟体内神经干细胞的生理与力学微环境。通过电动机控制下的蠕动泵作用，不仅使培养液处于相对高效的传质状态，而且能产生不同频率范围内的半正弦波、正弦波、方波等，使培养的神经干细胞获得类似侧脑室的力学激励机制。根据研究需要可施予不同变量的力学载荷，进而研究各种压应变条件下的细胞生物学行为。该细胞脉冲加载装置采用步进电动机作为动力系统来施加载荷，精确度可达到0.01mm，具有操作简单、精度高、实时记录跟踪等特点；另外，通过与计算机结合的数据采集卡，可以监测培养液的生化指标，保证细胞培养的生理状态，进而提高神经干细胞定向诱导及分化的概率。另外，生物硅胶膜的生物相容性良好，具有不易降解、吸收且透明度良好等特点。实验结果显示，采用的生物硅胶膜结构均匀、力学性能稳定，具有良好的载荷及应变对应关系，是比较理想的细胞基底培养材料。

然而，该细胞脉冲生物反应器所反映出的只是培养膜表观条件下的表观微应变，而细胞与细胞之间的黏附及张力无法直接通过设备的数据显示出来；而且，模拟的脉冲载荷与实际载荷仍存在一定差异。因此，在研究神经干细胞迁移、定向诱导、分化及力学响应机理的基础上，仍需细化细胞与细胞间的力学关系及相互作用，进而深入研究神经干细胞的力学生物学行为。

4 结语

该研究设计的生物反应器能模拟体内生物学及力学环境，对培养神经干细胞进行稳定、可靠的脉冲载荷及应变刺激，有望提高神经干细胞定向诱导为神经元样细胞的分化率，并为动态培养环境下神经干细胞迁移、定向诱导、分化及力学生物学机理研究提供一种可靠的平台。

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