猪繁殖与呼吸综合征毒株在Vero细胞上的增殖验证试验

陈晓春，吴华伟，王继文，邓 永，郎洪武，高金源∗，吴晓薇

（1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.北京出入境检验检疫局，北京100026；3.广东检验检疫技术中心，广州510623）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）自 1987年首次发现以来，在全世界范围内广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失［1］。特别是以高热、高发病率和死亡率为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征已成为长期危害我国养猪业发展的重大动物疫病之一。疫苗接种是预防PRRSV疫情发生的最有效途径之一。建立科学、有效、规范的疫苗质量评价体系在疫病防控中发挥关键的作用。大量数据已证实猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）能在猪原代肺泡巨噬细胞、传代细胞 Marc145、MA104、CL11171、CL-2621、HSo2H上生长，只是不同毒株在细胞上的增殖效率存在一定的差异［2］，而关于PRRSV在Vero细胞上的增殖存在异议［3-4］，且相关报道和文献较少。目前，由于国内各企业对于PRRSV能否在Vero等细胞上增殖认识不一，且高效、特异的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清制备困难，使得某些企业往往对样品不进行特异性血清中和处理便进行外源病毒检验，存在干扰真实检验结果的风险。为验证PRRSV在Vero细胞上的增殖情况，本研究将我国目前5个不同的PRRSV活疫苗毒株分别接种Vero细胞，同时通过细胞病变观察和荧光抗体检查确定其增殖效果，为规范PRRSV活疫苗检验、保障疫苗质量和猪繁殖与呼吸综合征疫病防控提供有益的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗（JXA1-R株）、高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗（TJM-F92株）、高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗（HuN4-F112株）、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-1R株）、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）各1批，每批3瓶，均为符合GMP要求的批签发合格产品。

1.1.2 细胞 Vero细胞由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供。

1.1.3 试剂 DMEM营养液为Gibco公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；FITC标记的抗PRRSV单克隆抗体为Bio X Diagnostics公司产品。

1.2 方法

1.2.1 接种 分别取5种疫苗各3瓶，用不含血清的DMEM营养液分别稀释为含10头份／mL，同批苗混合均匀后8000 r／min离心10 min，取上清液接种已长满80%Vero细胞单层的25 cm2细胞瓶各2瓶，每瓶接种1 mL，37℃吸附1 h，弃掉吸附液，用PBS洗涤1次后补加10 mL含2%胎牛血清的DMEM营养液，置37℃培养箱培养，每天观察细胞病变情况。如出现80%细胞病变，则收获病毒液。如未见细胞病变，则在培养5 d后收获培养物。

1.2.2 继代 将上述收获的培养物置-70℃冻融3次，3000 r／min离心10 min，取上清液如1.2.1项方法接种Vero细胞，如此继代，使总培养时间达14 d以上。最后一次继代时每个样品分别接种25 cm2细胞培养瓶2瓶和96孔细胞板20孔，37℃培养5～7 d，观察细胞CPE情况，并进行荧光抗体染色。

1.2.3 荧光抗体染色 取1.2.2项中最后一次继代的96孔细胞板，弃上清，PBS洗涤2次，用80%丙酮在2～8℃条件下固定20 min，自然干燥后按常规方法进行荧光染色，并置荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 细胞病变观察结果 5种疫苗在Vero细胞上传代培养，均能产生特异性CPE。其中TJM-F92株 PRRSV、HuN4-F112株 PRRSV、CH-1R 株PRRSV在接种的第1代（总培养时间第3天）即出现典型的CPE，JXA1-R株PRRSV在第2代（总培养时间第8天）开始出现典型CPE，R98株PRRSV在第3代（总培养时间第13天）开始出现典型CPE，病变细胞开始表现为圆缩，部分聚集且周围细胞变形、界限模糊，48 h左右病变细胞圆缩脱落可达80%以上（图2～图6）。

2.2 荧光抗体染色结果 5种疫苗样品在Vero细胞上的第3代细胞培养物经FITC标记的抗PRRSV单克隆抗体荧光染色，在感染细胞胞浆内均可见特异性翠绿色荧光（图8～图12），对照细胞未见荧光且背景纯净（图7）。

图1 正常Vero细胞对照（×200，下同）

图2 PRRSV CH-1R株病变情况

图3 PRRSV JXA1-R株病变情况图

图4 PRRSV HuN4-F112株病变情况

图5 PRRSV TJM-F92株病变情况

图6 PRRSV R98株病变情况

图7 Vero细胞对照（×200，下同）

图8 PRRSV CH-1R株荧光检测结果

图9 PRRSV JXA1-R株荧光检测结果

图10 PRRSV HuN4-F112株荧光检测结果

图11 PRRSV TJM-F92株荧光检测结果

图12 PRRSV R98株荧光检测结果

3 讨论

《中华人民共和国兽药典》二〇一〇年版三部规定［5］，在猪用病毒类活疫苗的外源病毒检验中，均应使用Vero细胞进行致细胞病变作用（CPE）和红细胞吸附性试验。对于“样品处理”除另有规定外，应对待检毒种或活疫苗用相应的特异性抗血清中和后作为检品进行检验。但在实际检验中，为简化操作步骤，节约检验材料，若疫苗抗原在该检验细胞上不能增殖或能够增殖但无致细胞病变作用（CPE）且无红细胞吸附作用，可以不用特异性抗血清对疫苗进行中和，即可进行外源病毒检验。美国兽用生物制品质量标准9CFR113.300也有相似规定［6］。本研究将目前国内用于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗生产的5个毒株未经中和接种Vero细胞，发现该5个毒株均能使Vero细胞产生细胞病变，培养物经FITC标记的PRRSV单克隆抗体检测，在胞浆内也能观察到特异性荧光。结果提示在进行这5个毒株相关产品的外源病毒检验时，需要进行特异性血清中和才能接种Vero细胞，否则在传代过程中造成的CPE会影响到外源病毒检验结果的判定。另外，目前WTO已批准了Vero细胞在疫苗生产中的使用，而Vero细胞微载体培养技术也已成功应用于流感病毒、狂犬病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、汉他病毒、牛呼吸道合胞体病毒的培养［7-10］。与转瓶培养相比，该技术具有产率高、稳定性好、易操控、易放大、成本低等优点。作为我国重要的动物传染病之一，PRRSV疫苗生产也应寻求可以替代传统转瓶培养的低效能生产模式的新技术新工艺，以有效发挥疫苗在我国防控政策中的基础性作用。该研究初步证实了PRRSV能在Vero细胞上增殖，这就提示将Vero细胞的微载体培养技术应用于PRRSV疫苗生产存在一定的可行性，进一步优化PRRSV疫苗微载体培养工艺将极大提升其生产水平。

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［5］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部［S］.

［6］美国兽用生物制品质量标准.http：／／www.ecfr.gov.

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