不同温度下白僵菌Bb04菌株对红火蚁工蚁的致病力

刘晓燕，吕利华，何余容*

1华南农业大学红火蚁研究中心，广东 广州510642;2广东省农业科学院植物保护研究所，广东 广州510640

红火蚁Solenopsis invicta Buren 属膜翅目Hymenoptera 蚁科Formicidae 切叶蚁亚科Mymicinae 火蚁属Solenopsis，是世界上危害最严重的入侵有害生物之一(曾玲等，2005)。红火蚁原分布于南美的巴拉纳河流域(Buren et al.，1974)，1930年红火蚁入侵美国阿拉巴马州莫比尔(Vinson，1997)。目前，红火蚁已扩散至美国13 个洲和波多黎哥的1.2 亿hm2的区域(Callcott，2002;Callcott ＆ Collins，1996)，在众多的加勒比海岛屿定殖(Davis et al.，2001)。2001年红火蚁入侵新西兰(Pascoe，2001)和澳大利亚(Natrass ＆ Vanderwoude，2001)。2003年红火蚁入侵中国台湾，2005年入侵中国大陆(曾玲等，2005)。

白僵菌是一种应用最广泛的虫生真菌，其已知寄主昆虫达200 种以上，被用于工厂化大量生产，可防治30 种农林害虫(高崇省和赵森，1996)。白僵菌属真菌被认为是红火蚁生物防治最有前途的真菌之一(Lofgren et al.，1975)。当从红火蚁上分离出球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals)Vuill.后(Alves et al.，1988;Stimac et al.，1987)，便被应用于红火蚁的防治。在巴西，田间试验结果显示，约80%的红火蚁因球孢白僵菌感染而死亡(Stimac et al.，1989)。球孢白僵菌虽然能寄生多种昆虫，但不同菌株对寄主的专化性和致病力有一定差异(蒲蛰龙，1978)，其致病力主要取决于菌株、害虫虫态及环境条件等因素(蒲蛰龙，1994)。国内外均有白僵菌在不同温度下对不同寄主致病力的研究(何余容等，2005;林华峰等，1998a、1998b;刘银泉等，2000;孙鲁娟等，2001;王晓红等，2007;Pandey ＆ Kanaujia，2004)。

在室内筛选对红火蚁具高致病力菌株的过程中，一株原始分离自橘小实蝇Bactrocera dorsalis Hendel 的球孢白僵菌B.bassiana Bb04 菌株表现出对红火蚁工蚁较强的致病力和较快的致死速率(吕利华等，2011)，显示出该株球孢白僵菌在红火蚁的生物防治中具有较强的应用潜力。为了更好地利用该白僵菌菌株防治红火蚁，本试验就温度对白僵菌Bb04 菌株致病力的影响进行初步研究，以期找出有利于白僵菌侵染红火蚁合适的温度范围，从而为制定田间应用白僵菌防治红火蚁的最佳时期奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试红火蚁采自广州市南沙区，于室内饲养，选取健康红火蚁工蚁。红火蚁蚁群的田间采集、室内蚁群的分离及饲养参照吕利华等(2006)方法。

1.2 供试菌株和孢子悬浮液的制备

将分离自橘小实蝇的球孢白僵菌SCAU-Bb04菌株，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养，用甘油试管法保存分生孢子于华南农业大学昆虫生态实验室-80 ℃的超低温冰箱中。试验时取出活化，转接于PDA 平板并保存于4 ℃冰箱中，待用。

将白僵菌Bb04 菌株接于PDA 平板，放入25 ℃、光照周期12L:12D 的培养箱中，培养7 d。待菌落产孢后，加入20 mL 0.03%吐温-80 无菌水，用接种针轻刮菌丝及孢子制成菌液。将菌液倒入200 mL烧杯中，用磁力搅拌器搅拌30 min。待孢子完全分散后，用双层医用纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液，即供试母液，用血球计数器计数母液的孢子浓度，再稀释成1 ×105和1 ×108个·mL-1的孢子悬浮液。

1.3 试验用人工气候箱

型号RXZ-300B，温度灵敏度±1 ℃，宁波市科技园区新江南仪器有限公司。

1.4 不同温度下白僵菌对红火蚁致病力的测定

采用喷雾法测定。用小型手动喷雾器(太阳神牌128 微型喷壶)将配制好的孢子悬浮液喷于100头红火蚁工蚁虫体上。0.03%吐温-80 无菌水处理作为空白对照。每处理100 头虫，3 次重复。将处理后的红火蚁工蚁放入底部铺有2 ～3 mm 厚石膏的有盖塑料杯中(底部直径7 cm，顶部直径9 cm，高6.5 cm)，在石膏中加入少许水，保湿。在杯盖上扎若干小孔，以便透气，在塑料杯内壁涂少量滑石粉，防红火蚁逃逸。将处理的供试虫体分别置于17、21、25、29 和33 ℃5 个恒温条件下培养，相对湿度85%以上，用棉花球吸取25%的蜂蜜水喂食红火蚁。每日检查并记录红火蚁的死亡数，连续观察15 d。根据虫体是否长出菌丝确定其死因，归类计数。

1.5 统计分析

采用数据处理系统(DPS)处理试验数据(唐启义和冯明光，2000)，计算致死中时(LT50)，利用多重比较法比较处理间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 不同温度下红火蚁工蚁的逐日累计死亡情况

在不同温度下接种白僵菌Bb04 菌株的红火蚁工蚁逐日累计死亡率见图1。由图1A 可知，1 ×105个·mL-1孢子悬浮液处理的红火蚁工蚁累计死亡率逐日上升缓慢，各温度条件下第15 天的累计死亡率均未超过40%。图1B 显示，1 ×108个·mL-1孢子悬浮液处理的红火蚁工蚁，在25 和29 ℃条件下，第2 天开始感病死亡，之后累计死亡率增加迅速，在第4 天累计死亡率已超过90%;而在17 ℃下，红火蚁工蚁到第7 天累计死亡率才达到90%。

图1 不同温度下红火蚁工蚁累计死亡率Fig.1 Daily cumulative mortality of red imported fire ants inoculated by B.bassiana under different temperatures

2.2 不同温度下红火蚁工蚁的死亡率

不同温度下第15 天红火蚁工蚁的累计死亡率结果见表1。结果表明，在17 ～33 ℃，白僵菌Bb04菌株均能侵染红火蚁工蚁，但在21、25 和29 ℃条件下，1 ×108个·mL-1孢子悬浮液处理的红火蚁工蚁在第15 天的累计死亡率均达100%，而在17和33 ℃时，其死亡率分别为99.36%和98.74%;在21、25、29 和33 ℃条件下，1 ×105个·mL-1孢子悬浮液处理的红火蚁工蚁在第15 天的累计死亡率分别为29.42%、36.18%、33.17%和27.21%，这4 个温度处理之间的累计死亡率差异不显著，但均显著高于17 ℃红火蚁工蚁的累计死亡率。

表1 不同温度下白僵菌Bb04 菌株处理的红火蚁工蚁累计死亡率Table 1 Cumulative mortality induced by the isolate Bb04 of entomopathogenic fungus B.bassiana at different temperatures

2.3 不同温度下白僵菌对红火蚁工蚁致病力的时间效应

将不同温度下用2 个浓度白僵菌Bb04 菌株处理后的红火蚁工蚁致病力数据进行机率值分析，得出其时间效应方程，求出致死中时(LT50)(表2)。由表2可以看出，在17 ～25 ℃，白僵菌Bb04 菌株对红火蚁工蚁的LT50随着温度的升高而缩短。当温度为29 和33 ℃时，红火蚁的LT50不减少反而增加。本试验结果表明，在25 ～29 ℃下，白僵菌Bb04菌株对红火蚁工蚁的致病力最强，是田间最适宜防治红火蚁的温度范围。

表2 不同温度下2 个浓度白僵菌处理的红火蚁工蚁的时间效应方程Table 2 Equation of time effect on RIFA worker induced by isolate of entomopathogenic fungus B.bassiana at two concentrations at different temperatures

3 讨论

本研究表明，在25 ℃，相对湿度85%以上，白僵菌处理浓度为1 ×108个·mL-1时，对红火蚁的致病力最高，致时中时最短，致死速率最快，第6 天的累计死亡率已达100%，致死中时(LT50)为2.57 d。据报道，白僵菌生长发育不同时期(如菌丝生长期和产孢期)的最适温度不尽相同，最有利于白僵菌菌丝生长的温度为25 ℃(孙鲁娟等，2001)。本试验结果表明，25 ℃时白僵菌对红火蚁的致病力最强，与菌丝生长的最适温度相吻合。

不同温度下白僵菌有不同的侵染途径。在适宜温、湿度下，主要从体壁侵染，而在低温环境下，则以消化道侵入为主(林华峰等，1998a)。在相对湿度为(90 ±10)%的情况下，高温更有利于白僵菌的萌发侵入;低温时，孢子萌发率低，甚至不萌发，侵入昆虫的速度较慢，主要依赖于随食物进入消化道的分生孢子进行侵染(孙鲁娟等，2001)。本试验相对湿度控制在85%以上，在此条件下，当白僵菌孢子悬浮液的浓度为1 ×105个·mL-1时，低温下(17 ℃)15 d 红火蚁工蚁的累计死亡率最低，表明低温不利于孢子的侵入;而当孢子浓度为1 ×108个·mL-1时，33 ℃时红火蚁工蚁15 d 的累计死亡率最低。此结果说明，虫生真菌对寄主的入侵不仅与温、湿度等环境条件有关，还与菌液浓度有关，许多有关白僵菌对害虫致病力的研究(何余容等，2005;林华峰等，1998a、1998b;刘银泉等，2000;孙鲁娟等，2001;王晓红等，2007)均证明了这一点。

本研究得出的试验结果与前人研究的有关白僵菌对其他昆虫的致病力所得出的结论存在一定差异，除试验条件不同外，还可能与病原菌的致病力和寄主的感病性有关，具体原因有待进一步探讨。但从白僵菌对红火蚁的致死中时及累积死亡率可看出，本试验所用的菌株对红火蚁具有较快的致死速度，表明其在红火蚁的生物防治中具有较强的应用潜力。

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