血清HB V-DNA荧光定量PCR检测与乙肝病毒标志物模式的相关因素探讨

颜 敏

湖北省医药学院附属医院十堰市人民医院检验科，湖北十堰 442000

乙型肝炎是世界上最为常见的严重危害人类健康的传染病，乙肝病毒(HBV)感染后可引起多种类型的急慢性肝炎，还是导致肝硬化、原发性肝细胞癌的主要原因，也是严重威胁患者生命的严重疾病[1]，目前研究表明乙型肝炎的发病率和病死率都有上升的趋势，在降低患者生活质量的同时危害生命安全[2]。现阶段对乙肝病毒感染的病理生理机制掌握上不全面，临床症状及表现形式复杂，病情迁延导致患者出现不同血清学标志物模式[3]，因此针对乙肝病毒血清标志物检测对于临床诊断乙肝病毒感染情况及传染性分析，同时指导临床科学治疗有着重要的临床应用价值。酶联免疫吸附法（ELISA）是检测乙肝病毒血清标志物的常用方法，但是检测率相对较低对于病毒早期感染检测效率差[4]，随着分子生物学的快速发展，聚合酶链式反应(PCR)引起特异性高、灵敏性强，已经广泛用于病毒的检测，尤其是实时荧光聚合酶链反应技术能准确检测患者体内HBV感染的具体状态，同时能对HBV-DNA的检测进行量化对比[5]，全面掌握病毒的复制状态和传染性，对于临床诊断和提供科学治疗方案有着重要作用。该研究2013年1月—2014年1月间通过血清HBV-DNA荧光定量PCR检测与乙肝病毒标志物模式的相关因素，旨在为探讨HBV－DNA含量与各种乙肝病毒标志物的关系，为进一步研究乙型肝炎病毒复制、感染性及临床抗病毒的研制提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择该院接受乙肝治疗的360例患者，其中男196例，女164例，年龄为23～69岁，平均年龄为(39.86±1.01)岁，所有患者均符合2000年第10次全国病毒性肝炎及肝病学术会议所制订的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断及分型标准，并排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎的重叠感染的患者，空腹采集患者血清，分离后进行分装备用。

1.2 方法

仪器与设备：HBV-DNA荧光定量PCR检测的试剂盒由达安基因生物工程股份有限公司提供，ELISA法乙肝血清标志物(HBVM)采用珠海丽珠有限公司乙型肝炎检测试剂盒，在美国ABI ViiATM7实时荧光定量PCR仪上测定，科华KHB ST-360型酶标仪、安图Iwo-960型洗板机。乙肝病毒血清标志物检测：应用ELISA法检测，根据试剂盒说明书的指导进行操作，应用酶标仪对结果进行读数并记录；HBV-DNA检测：采用荧光定量PCR的方法，取患者血清样本100 μL，加入100 μL DNA提取液，充分混合后用离心机12000 rpm离心10 min，弃去上清后加入 25 μL处理液，100℃水浴中预热10 min后再离心10 min，取2 μL上清液加入PCR管，应用PCR仪设定好正确程序进行检测，同时设置强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、阳性标准品对照，反应结束后应用阳性梯度标准品的Ct值制作标准PCR荧光曲线，再依据样品的Ct值计算DNA的含量[6]。

表1 血清乙肝病毒标志物(ELISA)和HBV-DNA荧光定量PCR检测结果分析

1.3 统计方法

应用SPSS 16.0软件对数据进行统计学处理，计量资料用均数±标准差()表示，组间比较采用t检验，计数资料用百分率比较，采用 χ2检验[7]。

2 结果

360例乙型肝炎患者血清标本有9种乙肝病毒标志物模式，其中 HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)组患者最多为 101例，其次为 HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)70例，HBsAg(+)、HBcAb(+)43例；阳性率比较HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)的阳性率最高为97.03%，其次为HBsAg(+)HBcAb(+)阳性率为88.37%和HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)阳性率为78.57%，全阴性阳性率最低为16.67%，最高阳性率与最低阳性率比较，差异有统计学意义(t=6.22，P=0.0154，P<0.05)，见表1。

3 讨论

目前随着乙型肝炎患者逐年增多及乙型肝炎病毒种类的不断变化，因此对于乙肝病毒的复制情况及感染能力的全面掌握对于临床治疗意义重大[8]，乙肝病毒标志物检测是诊断HBV感染的免疫学方法，能全面反映病毒侵入后机体的变化，HBVDNA测定则是病原学的检查范畴，能准确反映感染者的状态及病毒的感染类型和传染性强弱，是病毒复制的指标[9]。检测HBVDVA含量可直接反应乙型肝炎患者体内的病毒含量水平，一项肝炎患者血清中病毒标志物可直接反应患者体内的病毒含量。乙型病毒标志物呈多种模式，血清乙肝病毒标志物呈现不同表现形式，导致血清中HBV-DNA的检出率也会呈现不同结果。实时动态荧光定量PCR检测HBV-DNA是通过患者血液中病毒感染数量进行准确判断的方法，是一种结合普通PCR高灵敏度、DNA杂交高特异性、光谱技术高精确定量的优点对病毒DNA复制全面掌握的重要方式。该研究探讨血清HBV-DNA荧光定量PCR检测与乙肝病毒标志物模式的相关因素，结果表明乙肝大三阳即HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)检出率高且病毒含量高，小三阳即且HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)阳性率较低。这与施志龙、陈继梅在2011年研究结果一致[10]，表明HBeAg存在是乙肝病毒复制活跃的重要指标，患者血清中病毒拷贝数与HBeAg呈正相关。与相关文献报道[11]一致，乙肝病毒标志物与HBV-DNA有明显相关性，但是不同乙肝病毒标志物模式检出率差异显著。在大三阳患者检测HBV-DNA为阴性，分析原可能是治疗药物导致HBV-DNA无法正常复制，导致扩增物对应的乙肝病毒序列发生改变，患者体内的病毒被整合到肝脏细胞中，导致血液中无法检测病毒的存在，也可能是试剂的敏感性较差，在小三阳患者中阳性率明显低于大三阳患者，并且部分小三阳患者HBV-DNA的含量均较低，少部分患者血清中含量较高，此时病毒未停止复制，只是患者的病毒基因出现变异，仍然具有较强的传染能力。因此临床上应进行荧光定量PCR检测结果与血清乙肝病毒标志物指标结合评价，全面掌握病毒感染复制情况并指导临床科学治疗，对于统计分析病毒的流行病学特点和提高预后疗效有着重要价值。

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