当归轮作和连作根际土壤中致病菌变化研究

叶文斌+樊亮

摘要：以当归（Angelica sinensis）“90-02”号为材料，采用大田试验研究连作对当归产量和品质的影响，并测定了未种植当归的马铃薯田土壤（对照）和当归-马铃薯-当归轮作土壤、当归-当归连作土壤中尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的数量。结果表明，连作导致当归产量下降，其根鲜重、分根数均极显著下降，根长显著下降，对幼苗生长以及生理特性也有较大影响；当归-马铃薯-当归轮作土壤、当归-当归连作土壤中尖孢镰刀菌数量比种植马铃薯田土壤（对照）的均极显著增多，分别是对照土壤中的12.63和12.90倍，当归-当归连作土壤中尖孢镰刀菌数量与当归-马铃薯-当归轮作土壤的相比也极显著增多。结果表明，当归连作障碍导致其产量和品质均显著降低，尖孢镰刀菌数量增多是引起当归根腐病的主要原因，也可能是当归发育生长的主要障碍因素之一。

关键词：当归（Angelica sinensis）；连作障碍；尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）；数量变化

中图分类号：S567.53.044；Q945 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4364-04

连作障碍是指在正常的栽培管理措施下，同一块地连续多年种植相同作物（连作）造成作物产量降低、品质变劣、生长状况变差、病虫害发生加剧的现象[1]。许多作物都存在连作障碍，如豆类、水果类和蔬菜类[1-5]，许多中药材植物连作障碍也非常严重，如附子、地黄、丹参、苍术、西洋参、紫苏和薏苡等[6-10]。有研究认为连作障碍是作物根系分泌的自毒物质积累引起化感作用而导致的生长抑制作用[11]，也有学者认为植物的连作障碍是土壤肥力下降引起的[1，4-5，8-10，12]；现在越来越多的学者认为连作同一作物或同源作物会使特定的病原菌大量繁殖，导致土壤微生物群落及多样性受到破坏，病原拮抗菌数量减少，微生物种类单一，对下茬作物造成危害[11-13]，而轮作可以断绝病原菌的营养源从而减轻病害的发生，它能减缓连作障碍的发生。对于连作障碍的形成原因不同学者存在着不同的观点。

岷归（Angelica sinensis）又称当归，具有广泛的药用价值，是最常用的中药，民间素有“十方九归”之说[14]。岷县当归肉多枝少，气味香醇，个头整齐，无论是质量或数量，堪称全国第一，当归在甘肃省岷县产量占全国总产量的70%。由镰刀菌、腐霉菌和软腐细菌侵染造成的当归根腐病使幼苗猝倒、萎蔫、根腐，使成药期和贮藏期根部水浸状腐烂，严重影响了当归的产量和质量，致使岷县当归药材质量不稳定，严重影响了岷县当归在OTC市场发展中的地位，同时也影响了岷县当归在国内外的声誉[15]。长期的农业实践表明，当归连作导致当归根腐病害频发，当归生长受到严重影响，农业生产上采用“其他作物-当归”轮作形式规避这一危害。加快解决这一问题成为提高当归产量和质量的关键，然而关于当归连作障碍的发生原因以及种植地土壤微生物的相关研究未见报道。本试验以甘肃道地药材岷归为研究对象，采用大田试验比较连作对当归产量和品质的影响，揭示当归连作障碍机制，并测定新垦荒的种植马铃薯田的土壤、当归-马铃薯-当归轮作和当归-当归连作土壤中当归根腐病致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的数量，并对其分离纯化、培养和鉴定，为研究当归连作障碍机制和提高当归产量与品质提供理论与试验依据。

1 材料与方法

1.1 大田试验地气候和理化性质

大田试验地位于甘肃省岷县十里镇甘寨川当归种植示范基地。试验地海拔约2 200 m，年平均日照时间为2 214.9 h，年平均气温为5.7 ℃，绝对低温为-26.3 ℃，无霜期为120 d，年平均水量在817.8 mm左右，5～9月为雨季，占年总量的79.4%。试验地土壤理化性质：有机质含量为10.43 g/kg，总氮含量为1.82 g/kg，速效磷含量为10.47 mg/kg，速效钾含量为30.09 mg/kg，离子交换量为6.97 cmol/kg，pH 6.86。

1.2 试验材料

供试材料为当归“90-02”，由中国科学院近代物理研究所和甘肃省定西市旱作农业中心联合选育并提供。

1.3 大田试验与产量测定

在岷县种植当归期间（7月上旬），在已经备好的试验田起畦，畦长10 m，畦宽120 cm，畦高20 cm。在畦面上开设条沟，沟深约15 cm，沟宽约25 cm，将当归种子放入条沟中，芽头朝上，株距25 cm×25 cm，将开沟的泥土覆盖前沟，再行排种，依此类推，种植用量为150 kg/hm2。种植前用农家肥作为底肥，每公顷施350 kg[15]。翌年3月中旬出苗后，正常田间管理。试验处理组1：前茬种过当归后种植一茬马铃薯再种植当归的当归-马铃薯-当归轮作；试验处理组2：前茬种植过当归后，未经种植马铃薯而留待当归种植时继续种植当归的当归-当归连作。每个处理组面积各约200 m2。采收时（10月28日）分别取轮作和连作100 cm×100 cm样方测定产量，并分别计算各样方根数。拷种后每个样方选择20根当归测量其长度。每个处理用“五点采样法”在四周和对角线交叉处共取5个样方，每个指标测定重复5次。

1.4 当归植株生长生理特性测定

大田种植60 d后，待当归植株生长旺盛时，按照随机原则剪取当归植株顶部健康生长的第2、3片全展叶，带回实验室备用。用分光光度法测定叶绿素含量，用苯酚法测定可溶性糖含量，用标准曲线法测定游离脯氨酸的含量，用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[16]；按照参考文献[16，17]的方法，各取定量的当归叶片加入少量的缓冲溶液，低温研磨成匀浆，采用高速冷冻离心制得不同酶的粗提液，测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性。

1.5 致病菌的鉴定与根际土壤中致病菌数量的测定

选取发病植株并切取病株根茎木质部病健交界处，将组织切成0.5 cm×0.5 cm大小的薄片，先用流水清洗5～6次，用0.1% HgCl2消毒8 min后再将叶片分离出，用无菌去离子水清洗5～6次后，放入超净工作台备用。将灭菌的PDA培养基倒入培养皿内，然后在无菌条件下将患病组织1～2片贴在培养基中放入25 ℃光照培养箱中培养5 d，然后挑离培养的孢子纯化菌种[18，19]。将致病菌在PDA培养基上培养5～7 d后，观察菌落的外观、形态、菌丝体的颜色以及菌株分泌的色素在培养基中的颜色，鉴定后培养备用。用抖根法[15]将当归根际土壤和未种植过当归的马铃薯根际土壤（作为对照，该马铃薯土壤与当归根际土壤同质地）装到无菌取样袋中。所有土壤样品立即带回实验室进行无菌培养和菌群落数目测定。

1.6 数据统计分析

所有数据用SPSS 17.0软件统计分析。不同耕作处理下，当归采收后的产量指标用单因素方差（One-way）分析进行显著性检验（P<0.05或P<0.01）；土壤中的致病菌数量测定结果用单因素方差分析结合SSR多重比较统计分析。

2 结果与分析

2.1 连作对当归产量的影响

由表1可知，当归-当归连作的当归产量（根鲜重）明显下降，与当归-马铃薯-当归轮作比较差异极显著（P<0.01），当归-马铃薯-当归轮作产量为当归-当归连作的2.99倍。在连作条件下，当归产后根鲜重和分根数都明显下降，根也受到了生长抑制的影响，而当归产量在连作和当归-马铃薯-当归轮作条件下相比较，当归的分根数极显著地降低（P<0.01），而根长则显著减少（P<0.05）。轮作条件下的当归分根数约为连作条件下的2倍，根长也比当归连作条件下的长。

2.2 连作对当归幼苗中叶绿素含量的影响

叶绿素是植物光合作用物质生产的主要元件，与植物生产关系密切。由表2可以看出，当归轮作有助于提高幼苗植物的光合作用，提高光和效率，当归连作下当归幼苗叶片叶绿素a含量与当归-马铃薯-当归轮作相比极显著降低（P<0.01），叶绿素b和类胡萝卜素含量与当归-马铃薯-当归轮作相比显著降低和升高（P<0.05），叶绿素a/叶绿素b与当归-马铃薯-当归轮作相比极显著降低（P<0.01），叶绿素含量与当归-马铃薯-当归轮作相比极显著降低（P<0.01）。

2.3 连作对当归幼苗中可溶性糖、游离脯氨酸和丙二醛含量的影响

由表3可知，当归连作下当归幼苗中可溶性糖含量和丙二醛含量与当归-马铃薯-当归轮作相比都极显著升高（P<0.01）；连作下当归幼苗中游离脯氨酸含量与当归-马铃薯-当归轮作相比有显著的升高（P<0.05）。结果表明，当归连作后细胞膜脂质的过氧化程度增大，破坏了当归幼苗细胞膜的通透性，引起主动抗逆的应答机制，增加了渗透调节物质可溶性糖、游离脯氨酸和丙二醛物质的积累。

2.4 连作对当归幼苗SOD、POD和CAT的影响

由表4可知，不同耕作处理下当归幼苗体内的3种酶活性都发生了很大的变化。当归连作下幼苗叶片中SOD、POD和CAT活性与当归-马铃薯-当归轮作相比均极显著地降低（P<0.01）。这可能与轮作后增加了微生物的多样性，减少了致病菌对当归幼苗的伤害有关。

2.5 当归根腐病菌种的培养与初步鉴定

在PDA培养基上当归根腐病菌菌落呈乳白色、白色，菌丝较短、短绒状，气生菌丝不发达，中间有明显的隆起，菌落背面为浅黄色，由内向外逐渐变淡（图1）。分生孢子梗螺旋式伸长、不分枝，较长；大型分生孢子两端尖削或顶端尖，纺锤形至镰刀形弯曲或端直，具2～5隔，多数为3隔，大小为5.0 μm×30.0～37.5 μm；小型分生孢子数量少，梭形至肾脏形，单胞，无隔膜，大小为4.5～5.0 μm×5.0～10.0 μm；后垣孢子顶生或间生，椭圆形或球形，平滑（图2）。由此确定，该菌株为半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目瘤座孢科镰刀菌属的尖孢镰刀菌（F. oxysporum）。

2.6 当归根际土壤与对照土壤尖孢镰刀菌数量比较

当归连作根际土壤与马铃薯种植地对照土壤中尖孢镰刀菌数量的比较结果见表5。经统计分析和SSR多重比较可知，当归连作根际土壤与当归-马铃薯-当归轮作土壤中的尖孢镰刀菌数量比对照土壤的数量都极显著增加（P<0.01），而且当归连作与当归-马铃薯-当归轮作的根际土壤尖孢镰刀菌数量差异也呈极显著差异（P<0.01），这种现象表明在种植马铃薯后，土壤中尖孢镰刀菌数量是很少的，当种植当归后，土壤中尖孢镰刀菌数量增加明显，且当归连作下尖孢镰刀菌数量也明显增加。这说明，尖孢镰刀菌是当归生产中连作障碍的主要因素之一。

3 讨论

当归轮作与连作相比，轮作后产量提高，分根数也都有明显的升高。连作下当归幼苗中叶绿素和渗透调节物质可溶性糖、游离脯氨酸以及丙二醛的含量与轮作相比都受到了不同程度的影响；幼苗叶片中3种保护酶SOD、POD和CAT的活性都表现出显著的降低。为了研究根部致病菌和根际土壤中主要存在的微生物，通过分离、纯化、培养和鉴定后确定根部致病菌为半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目瘤座孢科镰刀菌属的尖孢镰刀菌（F. oxysporum）。

当归连作根际土壤中尖孢镰刀菌数量和当归-马铃薯-当归轮作中的数量比对照土壤中的数量极显著增加，而且通过对不同耕种次序的土壤菌落进行培养研究得到了证实，这说明，是由于尖孢镰刀菌引起连作障碍，影响了当归的正常生长和降低了当归的产量，尖孢镰刀菌是当归生产中连作障碍的主要因素之一。不同的耕作处理使当归幼苗的生长发育和产量差距都很明显，这是由于不同的耕作次序使得当归土壤中致病菌的数量不同引起的，因为当归根部的微生态系统是当归-种植地土壤微生物-环境相互作用的复杂系统，如何处理3者之间的关系可能是解决当归连作障碍问题的关键，在这个复杂的系统之中，当归致病菌尖孢镰刀菌扮演着重要的角色，连作后当归根际尖孢镰刀菌数量增多，感染当归后所产生的次生代谢产物在当归体内局部积累过多，破坏叶绿体结构而加速叶绿素分解，使叶绿素含量降低，影响到当归植物幼苗光合作用，紊乱了正常的生理代谢过程，进而影响当归根的生长和有机物质的积累，降低了当归产量。植物在逆境时为了适应和对抗不利条件，体内会积累大量的可溶性糖、游离脯氨酸和丙二酮等渗透调节物质[16，20]。当归连作后当归幼苗体内调节物质明显升高，这可能调节当归幼苗细胞内的渗透压，稳定细胞中酶分子的活性构象，保护酶免受直接的伤害，增强当归的适应能力和生活力，而且连作还会降低当归体内SOD、POD、CAT这3种酶的活性，破坏不同保护酶的平衡，引起当归生理生化过程的紊乱，最终导致生长抑制；也可能是致病菌产生的孢子丝或者次生代谢产物与带负电荷的当归细胞中的核酸结合引起染色体畸变、降低DNA和RNA活性，干扰核酸代谢[16]，最终导致的当归产量和品质的下降。这些不利于当归生长和发育的生理变化都与尖孢镰刀菌的数量和所产生的次生代谢产物有着紧密的关联，所以尖孢镰刀菌是当归生产中连作障碍的主要因素之一。而当归连作障碍的原因是一个非常复杂的生物学和农学问题，要彻底解决和弄清楚其机理有待更加深入的研究。

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