甘南高原野生与人工栽培翼首草根部多糖含量测定

丁耀光+马富花+付育红

摘要：翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]系川续断科翼首花属植物匙叶翼首花全草，富含植物多糖，块根可入药。通过超声波提取法从翼首草根部提取多糖，采用苯酚-硫酸比色法对其含量进行测定。结果表明，超声波提取的甘南高原野生翼首草的多糖含量为18.78 mg/100 mL，超声波提取的甘南高原人工栽培翼首草多糖含量为20.63 mg/100 mL，可见人工栽培翼首草根部多糖含量明显高于野生的。

关键词：翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]；多糖含量；甘南高原；人工栽培

中图分类号：O629.12 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4361-03

翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]系川续断科翼首花属植物匙叶翼首花全草，为常用藏药，藏语名为“榜孜毒乌、榜子毒乌、榜孜夺吾”等，为著名藏药“洁白丸”的主要成分之一。味苦、性寒，有小毒，有解毒、清热止痢、祛风除痹之功效。藏医常用它来治疗感冒发热及各种温热病引起的发烧，心中烦热，咳血、吐血、尿血、便血等症[1，2]。全世界翼首花属植物约25种，我国主要有匙叶翼首花和裂叶翼首花2种，分布于云南、四川、甘肃、青海和西藏东部海拔3 000 m以上的向阳地、草地、林间、林缘[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 翼首草采自甘肃省甘南藏族自治州合作市。该区域地处青藏高原东北部边缘，位于102°53′E、34°57′N，海拔高度为2 963 m。冬季寒冷而漫长，夏季温暖而短暂，全年日照充足，平均气温为-0.5～3.5 ℃，最高气温为28 ℃，最低气温为-23 ℃，平均无霜期为48 d，平均年降水量为545 mm，一般集中于7～9月。该地区属于亚高寒草甸湿润类型，适合生长多种双子叶、禾本科和莎草科植物。

1.1.2 药品与仪器 药品：40 g/L苯酚溶液、葡萄糖、正丁醇、石油醚、三氯甲烷、浓硫酸、乙醇，均为国产分析纯。仪器：CMD-20X型智能型电热恒温鼓风干燥箱、ORW1.5S-3E型微波萃取机、RE-52AA型上海亚荣旋转蒸发仪、天津华鑫SHZ-D（A）型循环水真空泵、离心机、分析天平（精确度为0.000 1 g）、HHS型数显恒温水浴锅、搅拌器。

1.2 方法

1.2.1 样品的预处理 将翼首草自然阴干，粉碎过20目筛，备用。采用粉碎法对匙叶翼首草样品进行预处理，预处理之后再用Sevage法[4]脱脂，用水煮提取粗多糖，对粗多糖除蛋白质，用水提醇沉法[5]提取纯净多糖，即得到纯净的翼首草多糖[6]。比色法广泛应用于多糖含量测定中，其中苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法是试验中测定多糖含量的常用方法[5]。而苯酚-硫酸比色法测定多糖含量的准确度较高，因此本研究选用此方法。

1.2.2 脂的脱除 称取10 g制备好的翼首草样品装入圆底烧瓶中，加100 mL的石油醚（沸程60～90 ℃），在85.5 ℃的恒温水浴中回流提取50 min，冷却，离心4 min回收石油醚，重复两次，晾干残渣中华的溶剂，备用。

1.2.3 粗多糖的提取 在250 mL圆底烧瓶中加入去离子水和脱脂后的匙叶翼首草残渣，以超声波功率500 W、料液比1∶15（m/V，g∶mL）、提取时间30 min[7]提取1次，离心6 min，抽滤，收集滤液；再将滤液加入旋转蒸发仪，重复两次，浓缩至约30 mL。

1.2.4 蛋白质的去除 将上一步获得的溶液倒入锥形瓶，加入三氯甲烷-正丁醇（体积比5∶1）混合溶液20 mL，搅拌20 min，离心7 min，收集上层溶液，本试验共重复7次至无蛋白质沉淀出现。除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检测，如果在波长280 nm处无吸收，表明蛋白质已经除尽[8]。

1.2.5 多糖的乙醇沉淀 将多糖离心后所得的溶液转入100 mL量筒中，加入无水乙醇（溶液和无水乙醇的体积比为1∶5），将得到的多糖混合溶液静置24 h，然后将溶液抽滤，收集滤渣，将滤渣真空干燥，得到翼首草多糖产品。

1.2.6 多糖含量的测定

1）测定方法。采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为参照物，使用紫外可见分光光度计对制备出的产物的多糖含量进行测定。

2）最大吸收波长的确定。用移液管取适量样品溶液，向其中加入显色剂，在波长400～600 nm范围内进行检测[9]，绘制出吸收曲线。

3）最佳显色时间的确定。显色反应是较为复杂的有机反应，需要一定的时间才能显色完全[10]。在不同的显色时间下测定其吸光度，确定吸光度最大的显色时间。

4）标准溶液的制备。标准溶液的配制方法是：称取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容于100 mL的容量瓶中[11]，再用移液管吸取标准溶液0、2、4、6、8和10 mL，定容至100 mL容量瓶中。

5）标准曲线的绘制。取上述标准溶液1 mL于具塞试管中，分别加1 mL 40 g/L苯酚，快速加入7 mL浓硫酸，振荡4 min，显色30 min，于490 nm波长处测定吸光度，以二次去离子水作空白对照试验，以Y轴为吸光度A，X轴为葡萄糖浓度（mg/mL），得到标准曲线。

6）换算因子的测定。精密称取干燥至恒重的多糖样品0.010 5 g，置于100 mL容量瓶中，定容。移取该溶液1 mL，定容于10 mL容量瓶中，即制得待测溶液。吸取1 mL待测液，显色测定吸光度，依据回归方程得到溶液中的葡萄糖浓度，由公式f=m/c×D计算得出f，其中m表示多糖质量（g），c表示多糖液中葡萄糖的浓度（mg/mL），D表示多糖稀释倍数，即稀释前的溶液浓度除以稀释后的溶液浓度[12]。

7）3份待测样品的制备。选取3份匙叶翼首草根部，用微波萃取机超声波提取多糖，精密称取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。将匙叶翼首草多糖3份样品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1号、2号、3号样品。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的检测

为了检测样品中蛋白质是否除尽，在波长280 nm[13]处用紫外分光光度计检测，检测结果表明紫外吸收为零，蛋白质已除尽。

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 最大吸收波长的确定 由图1的吸收曲线可知，最大吸收波长为490 nm。

2.2.2 最佳显色时间的确定 由图2可知，显色30 min时有最大的吸光度，所以最佳显色时间为30 min。

2.2.3 标准方程的获得 标准曲线见图3。标准曲线方程为y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 换算因子的测定结果 根据回归方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖样品的浓度为0.064 1 mg/mL，由换算因子公式f=m/c×D计算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个重复试验的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表1。表1结果表明，3份样品中多糖含量分别为18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，说明测定误差极小。

2.2.6 人工栽培样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个样的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表2。表2结果表明，3份样品中多糖含量分别为20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，说明测定误差极小。

3 小结与讨论

通过超声波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的产率。在翼首草多糖含量的测定中，选用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为对照品，使用紫外可见分光光度计测定制备出的产物中的葡萄糖含量。结果表明，超声波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量为18.78 mg/100 mL，超声波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量为20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明显高于野生的。

参考文献：

[1] 刘 圆，张 浩，尚远宏，等.藏药甘松及翼首草生药学鉴定[J]. 时珍国医国药，2006，17（10）：1891.

[2] 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（下册）[M].北京：人民卫生出版社，1975.688.

[3] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志（第73卷，第1分册）[M].北京：科学出版社，1996.

[4] 李知敏，王伯初，周 菁，等.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较分析[J].重庆大学学报，2004，27（8）：57-59.

[5] 夏 莲，孙志伟，李国梁，等.藏药蕨麻多糖的光谱性质及单糖组成分析[J].天然产物研究与开发，2011，23（3）：453-457.

[6] 孙 婕，吕灵娟，尹国友，等.植物多糖的提取技术与功能研究进展[J].农产品加工，2011（7）：63-64.

[7] 郝博慧.蕨麻多糖的提取、纯化以及单糖组成的初探[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2010.

[8] 王谢忠，胡庭俊，李晓明，等.蕨麻多糖的提取、含量测定和理化性质分析[J].中兽医医药杂志，2006（2）：34-35.

[9] 贾亮亮，袁 丁，何毓敏，等.多糖提取分离及含量测定的研究进展[J].食品研究与开发，2011，32（3）：189-192.

[10] 夏 莲，孙志伟，李国梁，等.藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究[J].分析科学学报，2010，26（1）：26-30.

[11] 王航宇，刘金荣.新疆枸杞多糖的超声提取及含量测定[J].中药材，2002，25（1）：42-43.

[12] 骆健美，卢学英，张敏卿.微波萃取技术及其应用[J].化工进展，2001，30（12）：46-49.

[13] 里跟林，杜天信，梁生旺.怀牛膝中多糖的量[J].中国实验方剂杂志，2002，8（5）：6-7.

7）3份待测样品的制备。选取3份匙叶翼首草根部，用微波萃取机超声波提取多糖，精密称取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。将匙叶翼首草多糖3份样品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1号、2号、3号样品。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的检测

为了检测样品中蛋白质是否除尽，在波长280 nm[13]处用紫外分光光度计检测，检测结果表明紫外吸收为零，蛋白质已除尽。

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 最大吸收波长的确定 由图1的吸收曲线可知，最大吸收波长为490 nm。

2.2.2 最佳显色时间的确定 由图2可知，显色30 min时有最大的吸光度，所以最佳显色时间为30 min。

2.2.3 标准方程的获得 标准曲线见图3。标准曲线方程为y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 换算因子的测定结果 根据回归方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖样品的浓度为0.064 1 mg/mL，由换算因子公式f=m/c×D计算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个重复试验的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表1。表1结果表明，3份样品中多糖含量分别为18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，说明测定误差极小。

2.2.6 人工栽培样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个样的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表2。表2结果表明，3份样品中多糖含量分别为20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，说明测定误差极小。

3 小结与讨论

通过超声波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的产率。在翼首草多糖含量的测定中，选用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为对照品，使用紫外可见分光光度计测定制备出的产物中的葡萄糖含量。结果表明，超声波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量为18.78 mg/100 mL，超声波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量为20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明显高于野生的。

参考文献：

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[3] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志（第73卷，第1分册）[M].北京：科学出版社，1996.

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[9] 贾亮亮，袁 丁，何毓敏，等.多糖提取分离及含量测定的研究进展[J].食品研究与开发，2011，32（3）：189-192.

[10] 夏 莲，孙志伟，李国梁，等.藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究[J].分析科学学报，2010，26（1）：26-30.

[11] 王航宇，刘金荣.新疆枸杞多糖的超声提取及含量测定[J].中药材，2002，25（1）：42-43.

[12] 骆健美，卢学英，张敏卿.微波萃取技术及其应用[J].化工进展，2001，30（12）：46-49.

[13] 里跟林，杜天信，梁生旺.怀牛膝中多糖的量[J].中国实验方剂杂志，2002，8（5）：6-7.

7）3份待测样品的制备。选取3份匙叶翼首草根部，用微波萃取机超声波提取多糖，精密称取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。将匙叶翼首草多糖3份样品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1号、2号、3号样品。

2 结果与分析

2.1 蛋白质的检测

为了检测样品中蛋白质是否除尽，在波长280 nm[13]处用紫外分光光度计检测，检测结果表明紫外吸收为零，蛋白质已除尽。

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 最大吸收波长的确定 由图1的吸收曲线可知，最大吸收波长为490 nm。

2.2.2 最佳显色时间的确定 由图2可知，显色30 min时有最大的吸光度，所以最佳显色时间为30 min。

2.2.3 标准方程的获得 标准曲线见图3。标准曲线方程为y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 换算因子的测定结果 根据回归方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖样品的浓度为0.064 1 mg/mL，由换算因子公式f=m/c×D计算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个重复试验的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表1。表1结果表明，3份样品中多糖含量分别为18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，说明测定误差极小。

2.2.6 人工栽培样品溶液中多糖含量的测定结果 分别从稀释100倍的1号、2号、3号样品中取1 mL溶液于具塞试管中，显色测吸光度，每种样品重复3次，每个样的吸光度分别记为A1、A2、A3，平均值为A，结果见表2。表2结果表明，3份样品中多糖含量分别为20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，说明测定误差极小。

3 小结与讨论

通过超声波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的产率。在翼首草多糖含量的测定中，选用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为对照品，使用紫外可见分光光度计测定制备出的产物中的葡萄糖含量。结果表明，超声波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量为18.78 mg/100 mL，超声波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量为20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明显高于野生的。

参考文献：

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[3] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志（第73卷，第1分册）[M].北京：科学出版社，1996.

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[5] 夏 莲，孙志伟，李国梁，等.藏药蕨麻多糖的光谱性质及单糖组成分析[J].天然产物研究与开发，2011，23（3）：453-457.

[6] 孙 婕，吕灵娟，尹国友，等.植物多糖的提取技术与功能研究进展[J].农产品加工，2011（7）：63-64.

[7] 郝博慧.蕨麻多糖的提取、纯化以及单糖组成的初探[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学，2010.

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[9] 贾亮亮，袁 丁，何毓敏，等.多糖提取分离及含量测定的研究进展[J].食品研究与开发，2011，32（3）：189-192.

[10] 夏 莲，孙志伟，李国梁，等.藏药蕨麻多糖水解单糖的毛细管区带电泳分离研究[J].分析科学学报，2010，26（1）：26-30.

[11] 王航宇，刘金荣.新疆枸杞多糖的超声提取及含量测定[J].中药材，2002，25（1）：42-43.

[12] 骆健美，卢学英，张敏卿.微波萃取技术及其应用[J].化工进展，2001，30（12）：46-49.

[13] 里跟林，杜天信，梁生旺.怀牛膝中多糖的量[J].中国实验方剂杂志，2002，8（5）：6-7.