影响体外组织培养保存关节软骨活性的因素

李雪芳 亓建洪 宋洪强

泰山医学院运动医学研究所，山东泰安 271000

影响体外组织培养保存关节软骨活性的因素

李雪芳 亓建洪 宋洪强▲

泰山医学院运动医学研究所，山东泰安 271000

体外培养保存的关节软骨组织是关节软骨移植材料重要来源。但是由于保存时间偏短的弊端限制了其临床应用。软骨组织从相应的供体取出后如何在体外保存，在保存过程中又有哪些因素影响软骨细胞的存活率是众多学者一直研究的问题。本文从影响体外培养保存软骨组织活性的Wnt/β-catenin信号通路、癌基因、应力、细胞因子、中药等因素入手，系统地分析了影响体外组织培养保存关节软骨活性的因素，以期为软骨保存方法的下一步改良提供参考依据。

关节软骨；Wnt/β-catenin信号通路；癌基因；应力；细胞因子；中药

随着现代经济水平的发展以及人们运动意识的增强，各种原因导致的关节软骨损伤患者数量迅猛增加。目前同种异体软骨移植技术是治疗该损伤的理想方法之一，该技术分为自体和异体移植。自体移植的软骨来源有限，给患者造成再次损伤，所以应用较少。异体组织移植能很好的解决这个问题，但异体软骨组织在体外如何保持良好的活性进而保障较高的植入存活率一直是困扰的难题。由于影响因素众多，本文从典型的内部机制及外部作用因素进行综述。

1 Wnt细胞信号通路对软骨组织体外保存活性的影响

Wnt信号通路是近年来发现的对细胞发生发展有异常作用的通路，可分为经典通路（Wnt/β-catenin通路）和非经典通路（Wnt/PCP信号通路、Wnt/Ca2+通路）。本文主要分析经典通路对体外保存软骨组织活性的影响。研究显示，Wnt/β-catenin通路是软骨发育、关节形成的重要调控机制。经典信号通路主要由以下部分组成：β-catenin、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、轴蛋白（axin）、APC（adenomatous polypo siscoli）、胞质内Disheveled（DSH）蛋白、酪蛋白激酶α（CKlα）等，其中axin、APC、GSK-3β、CKⅠα组成的复合体可以调切细胞内的β-catenin水平，具体作用机制是DSH发生磷酸化后向细胞膜聚集，与axin、APC、GSK-3β、CKⅠα组成的复合体相结合，Frat1/GBP通过胞质内 DSH蛋白进入该复合体，与axin竞争结合GSK-3β，进而阻断β-catenin的降解。总的来说，经典的信号通路可以概括为：跨膜受体Frizzled蛋白（Frz蛋白）与低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6（LRP5/6）组成的共同受体，可与Wnt蛋白相结合，进而激活Wnt/ β-catenin信号途径。近年来许多研究通过在培养液中添加一些特定的因子激活或者抑制Wnt/β-catenin信号通路后，观察Wnt/β-catenin信号通路变化对软骨组织体外保存的影响，如Wnt/β-catenin通路与HMGB2相互作用可以维持软骨表浅区的稳定，HMGB2可以使LEB-1-β-catenin复合体的活性增强，进而拮抗β-catenin作用，促进软骨细胞的存活[1]；SFRP5（secreted frizzled related protein-5）是Wnt分子的拮抗剂，通过对大鼠的FRZB或SFRPS抑制实验发现，膝关节软骨细胞中MMPs活性增强，蛋白聚糖减少[2]；还有研究表明通过添加Wnt分子抑制剂DKK-1可以减缓软骨病变[3]。

Wnt信号通路对体外保存软骨组织活性的作用是多方面的，既有促进软骨发育的一面，又有促进软骨老化、诱发骨性关节炎的一面，但其具体原因尚不明确，目前对Wnt信号通路的研究报道甚少。Wnt信号通路是控制软骨组织体外保存活性的新突破，对其做深入研究有重要意义。

2 癌基因对软骨组织体外保存的影响

软骨组织体外保存的良好活性依赖于各相关基因之间的平衡。

2.1 p53基因

p53基因与人类肿瘤的相关性最高，可分为野生型和突变型，其中野生型p53可诱导关节软骨细胞的凋亡，在凋亡细胞中表达阳性，是细胞周期和DNA修复的重要调节因子，并且还可以限制细胞的生长，在细胞凋亡过程中起关键信号作用[4]。

2.2 Bcl-2基因家族

目前记载的Bcl-2家族成员最少有25个，根据其结构和功能的不同分为促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad、Bik等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等）。研究显示，Bcl-2家族主要位于细胞的线粒体膜、内质网膜等相关部位，其作用机制是通过调节线粒体膜的通透性，影响膜电位和细胞色素C的释放，通过调节内质网腔内Ca2+浓度来影响细胞的活性[5]。Bcl-2基因主要在18号染色体上，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能[6]。Bcl-2家族均含有一种以上共有的同源结构域（Bcl-2 homology，BH），分别为BH1、BH2、BH3、BH4，其家族成员可借此结构域形成同源或异源性二聚体。软骨细胞的存活和二聚体之间的平衡相关，Bax过量，形成Bax二聚体，细胞趋于凋亡；Bcl-2过量，形成Bcl-2二聚体，细胞趋于存活。另外，Bax和Bcl-2也能形成二聚体，Bax/Bcl-2比值升高则抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡，所以Bcl-2和Bax共同调节了软骨细胞的凋亡[7]。

2.3 c-myc基因

近年来通过对疗程性细胞死亡的研究，发现c-myc基因的表达失调会导致多种细胞凋零，细胞凋零的发生速度及对诱导因素的敏感性都和细胞内myc蛋白含量有关。人类c-myc基因主要存在于第8对染色体上，它的表达产物是含有439个氨基酸的蛋白质。一些研究显示c-myc在凋亡的软骨细胞核中有少量表达，并且c-myc参与OA患者软骨细胞凋亡的全过程，其具体机制是c-myc通过参与转录对软骨细胞的存活产生影响。Hiyama等[8]研究发现，c-myc所需细胞增殖的关键蛋白的表达是通过Wnt信号传导调节，研究还发现，通过氯化锂激活Wnt信号会导致c-myc的启动子活性和表达的抑制，结果表明，c-myc是促进细胞增殖的重要因素。

2.4 ICE基因家族

ICE基因家族是半胱氨酸转化酶的一种，因与ced-3同源，所以被统一命名为半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase），有人将Caspase称为ICE家族，ICE为Caspase-1，目前已发现的Caspases至少有14种[9]。Caspase家族的相关成员在细胞凋亡以及信号传导过程中发挥着重要作用，当它们活化后可激活DNA内切酶，使DNA发生片段化和凋亡。

3 应力变化对软骨组织体外保存的影响

软骨组织在正常生理环境下靠周期性应力产生的形变（抽吸作用）吸取关节液中的营养，这也是软骨组织唯一的营养摄取途径[10]。Klein等[11]发现关节软骨组织各层的受力特性并不同，软骨细胞可根据受力程度的不同分为三层，表层软骨细胞密度高，为扁盘凹状，极化明显排列于软骨的表面，主要以抗剪切力为主；中层密度中等，相对稀疏，为圆形，以抗压力为主；深层细胞密度最小，呈柱状并以潮线为基线排列，深层对前两者均有一定的抗性；最下层是软骨下骨[12]。不同性质的力学刺激对软骨组织的影响不同，当应力较小时深层软骨细胞比表、中层细胞发生的形变更大，这种变化主要体现在细胞的宽度，当应力较大时（＞0.2 MPa），中层细胞发生的形变是最大的[13]。大量的研究资料证实生物力学可对关节软骨产生积极影响[14-18]，但也有相反的报道。目前对于应力刺激如何影响软骨组织的确切机制还不清楚，有待进一步研究。

4 细胞因子对软骨组织体外保存的影响

研究显示多种细胞因子如白细胞介素（IL）、转化生长因子（TGF）-β、胰岛素样生长因子（IGF）-Ⅰ、肿瘤坏死因子（TNF）等对软骨修复有着不可忽视的作用。

4.1白细胞介素

IL是一组由多种类型细胞所分泌的结构和功能各异的可溶性蛋白，根据其对软骨修复的影响，大致可分为促炎因子（主要为IL-1、IL-11、IL-17和IL-18等）、抗炎因子（主要为IL-4、IL-10和IL-13等）和调节因子（主要为IL-6和IL-8）。其中IL-1可抑制软骨细胞增殖，使软骨细胞外基质蛋白多糖合成减少，细胞释放炎性因子（如IL-6、17、18）增加，并可与软骨细胞表型分化相关的基因发生作用[19]。IL-1尚可以诱导软骨细胞凋亡，加重关节软骨破坏程度。Jikko等[20]报道，调节因子IL-6也可以抑制软骨细胞的增殖和蛋白多糖的合成。

4.2转化生长因子-β

TGF-β参与细胞生长和细胞外基质合成等相关过程。哺乳动物中已发现的亚型有TGF1、2、3，几乎体内的每个细胞都产生TGF并存在其受体。TGF-β在细胞增生、修复创伤，细胞外基质形成，骨的重建等方面有着重要作用，还可以抑制炎性介质（IL-1、IL-6，TNF-α等）的活性和免疫反应等，对软骨细胞的作用是双向的[21]。

4.3胰岛素样生长因子

IGF-Ⅰ是最早被证实对关节软骨具有促进合成代谢作用的生长因子之一。IGF-Ⅰ与软骨细胞膜上的IGF-Ⅰ受体结合，以旁分泌和自分泌方式起作用，从而刺激软骨细胞的增殖，是软骨细胞基质合成及基质结合蛋白合成的有效刺激剂。IGF-Ⅰ还有促进软骨细胞形成软骨组织的作用。

4.4肿瘤坏死因子

1975年Carswell等研究发现，给接种过卡介苗的老鼠注射细菌脂多糖后，血清中会出现一种使多种肿瘤产生出血性坏死的物质，从而将它命名TNF。1985年Shalaby将TNF命名为TNF-α和TNF-β两类，其中TNF-α为促炎细胞因子，作用机制与IL-1类似，是参与软骨基质降解的重要介质，通过上调MMP的基因表达发挥作用，还可以减少胶原和蛋白多糖的生成[22]，使关节软骨基质发生降解，进而影响软骨细胞的存活。

5 中医中药对软骨组织体外保存的影响

近年来中医中药对软骨组织体外保存的研究成为了热点，但关于其具体机制及何种药物能促进或抑制软骨组织体外保存活性的研究甚少。国内有研究中药蛇床子对软骨细胞增殖作用影响的实验，明磊国等[23]研究发现，高浓度蛇床子素抑制成骨细胞生长，低浓度对生长无影响，但可以促进成骨。也有研究发现，鹿茸多肽对OA过程中发生的软骨细胞凋亡有抑制作用，可以降低关节液中的TNF-α 和IL-1β，在某些程度上延缓了关节软骨的退变[24]。李西海等[25]研究显示，独活寄生汤可通过影响神经-内分泌-骨代谢系统、神经-内分泌-免疫系统和抑制软骨凋亡的信号通路，参与调控软骨下骨及软骨的功能，延缓软骨病变。中药成分对软骨组织体外保存的研究是一个新兴的课题，其作用机制研究尚浅，如何选用中药成分保持软骨组织较高活性需要更多学者继续努力。

6 结束语

以上资料提示软骨组织体外保存活性受多种因素的影响，目前对较为热点的Wnt/β-catenin信号通路研究较少，该通路的变化对软骨组织活性的影响有待进一步研究，而对其他相关基因、应力、细胞因子等影响因素的研究越来越深入。中医中药对软骨组织活性调控的研究目前尚属起步阶段，但有越来越多的人员开始关注这一方面。软骨组织的体外保存培养还需要深入研究，相信在不久的将来，软骨损伤将不再是困扰人们的一个难题。

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随着时代的发展，无线网络通信技术的应用范围更加广泛，这也给无线网络环境的安全提出了更高的要求。当前无线网络通信中采用的安全技术主要包括WPKI技术和IBC技术两种。其中WPKI技术是在有线网络PKI基础上建立起来的，只对无线通信网络中的无线环境部分进行了改进，所以WPKI技术在无线网络通信环境中的应用局限性较大。而BIC则结合了无线网络通信技术的特点，是一项专门针对无线网络环境的安全技术。因此，未来无线网络通信安全技术的发展也必将以IBC技术为主。

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The factors affecting in vitro tissue culture preservation activity of articular cartilage

LI Xue-fang QI Jian-hong SONG Hong-qiang▲
Sports Medicine Institute of Taishan Medical College,Taian 271000,China

Articular cartilage of vitro tissue culture preservation is an important source of articular cartilage graft material.However,storage time is too short to apply in clinica.Many scholars have always researched that how to preserve the cartilage removed from the donor and what factors influence the chondrocytes survival during tussue culture in vitro.This article systemically analyzes the factors affecting of preservation activity of tissue culture articular cartilage,including Wnt/β-catenin signaling pathway,cytokines,oncogenes,stress,chinese medicine and so on.It hopes to provide a good reference for the improvement of cartilage preservation methods.

Articular cartilage;Wnt/β-catenin signaling pathway;Oncogene;Stress;Cytokines;Chinese medicine

R322.7+1

A

1674-4721（2014）010（a）-0194-03

2014-08-15本文编辑：祁海文）

山东省自然科学基金（ZR2012HL22）；山东省医药卫生科技发展计划项目（2011HW082）

李雪芳（1985-），女，2011级在读硕士研究生

▲通讯作者：宋洪强（1977-），男，硕士，讲师，主要研究方向：关节软骨损伤与康复