HPLC-MS/MS法检测家禽鸡可食组织中阿奇霉素的残留量

（金华市质量技术监督检测院，浙江金华321000）

目前大多数兽药残留分析采用了HPLC法，但HPLC至今仍缺少可满足兽药残留分析要求的通用型检测器。HPLC—EC和HPLC—MS法样品前处理简单[1-2]，选择性好，灵敏度高，现在一般地区级以上的检测部门均已配备HPLC-MS/MS，然而作为食品中阿奇霉素残留测定的标准却仍未建立，本文参考国内外有关文献及数据的基础上[3-6]，首次建立高效液相——质谱联用（HPLC-MS/MS）法测定鸡可食组织中阿奇霉素的残留，为保证动物源性食品安全提供一种快捷、灵敏、可靠、准确的检测技术，也为药物在家禽体内的药代动力学研究提供定量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验与仪器

阿奇霉素标准品，50 mg，97.0%，20℃保存，德国dr.ehrenstorfer公司，由上海安谱科学仪器有限公司代购；所用试剂除乙腈、甲醇为色谱纯，除水为超纯水外其余均为国产分析纯。

液质联用仪LC、1200 DAD和6410B QQQ质谱检测器：美国Agilent1200公司；色谱柱XDB-C18，1.8μm，2.1×100 mm：美国Agilent公司；高速冷冻离心机，BIOFUGE STRATOS：美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

精密称取鸡可食组织2.0 g样品磨碎，加入匀浆介质磷酸盐缓冲液（pH7.5）4 g，匀浆机5 000 r/min匀浆10 min，制成匀浆组织液；准确称取1.5 g匀浆组织液（相当于0.5 g鸡可食组织）于10 mL离心管中，再加0.5 mol/L氢氧化钠溶液100 μL，旋涡震荡2 min，加含5%异丙醇的氯仿4 mL，旋涡震荡萃取10 min，离心（10 000 r/min）5 min， 精密量取有机层2.0 mL，45℃水浴氮气流吹干，加流动相100 μL涡旋2 min，4 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜过滤，超声波清洗器中超声20 min，取5 μL进样HPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18， 1.8 μm，2.1×30 mm；检测器：Agilent 1200 DAD检测器；流动相：A：60%水（0.1%甲酸），40%甲醇；流量：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：25℃；检测波长：195 nm。

1.2.3 肉鸡组织标准曲线的制备

准确称取1.5 g匀浆液（相当于鸡可食组织0.5 g）于10 mL离心管中，加入阿奇霉素标准溶液，使组织中阿奇霉素浓度分别为 0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.4、0.8、1.0 μg/mL的系列标准组织样品。旋涡震荡10 min。后续操作同样品处理方法。

1.2.4 组织加标回收率测定

取空自鸡肉组织样品，加阿奇霉素工作液配制成0.05、0.10、0.50 μg/g 3 个水平的鸡肉样品，按标准曲线制备方法处理后进行测定，同时将对应3个水平的阿奇霉素用流动相溶解作HPLC-MS/MS分析，每个样品均重复5次，以峰度比定性，按定量离子峰面积定量来求得药物回收率。

1.2.5 稳定性试验

按组织加标回收率方法制得0.05、0.10、0.50 μg/mL（或μg/g）3个水平的阿奇霉素浓度，按标准曲线制备的方法，每个批次作8个重复，共作5个批次，测得实际浓度，求出每个浓度的批内和批间变异系数（RSD）。

2 结果与分析

2.1 色谱结果

在阿奇霉素液质联用参数研究选定的优化色谱条件下，阿奇霉素保留时间在1.2 min～1.4 min之间，添加标准品的样品色谱峰峰形较佳，为基线分离峰。

优化后，质谱的相关色谱条件为a）电离方式：电喷雾电离，正离子；b）离子喷雾电压：400 V；c）雾化气：氮气，45 psi；d） 干燥气： 氮气， 流速11 L/min， 温度350℃；e）碰撞器：氮气；f）扫描模式：MRM，母离子 m/z 749.5，定量离子 m/z589.5，定性离子 m/z157.8；g）驻留时间：200 ms；h） 裂解电压 160 V；i） 碰撞能量：m/z 749.5＞589.5为20 V，m/z749.5＞157.8为20 V。

2.2 标准曲线与最低检测限

图1 阿奇霉素标准液总离子流、特征离子峰度Fig.1 Azithromycin standard solution total ion current，characteristic ion peaks

鸡肉组织中的阿奇霉素工作液在选定的色谱条件下用HPLC-MS/MS测定，以出现药物峰的最低组织药物浓度作为判定药物在组织中的最低检测限。标准浓度在0.001 μg/mL时，生鸡蛋加标在1.231 min处出现一小峰，可作为最低检测限（LOD）。当加标后最终药物浓度在低浓度范围 0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 与高浓度范围 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL 内，纵轴色谱峰面积（S），与横轴各浓度（C）分别呈现良好的线性关系，得到各组织标准曲线的线性回归方程和相关系数，阿奇霉素的最低定量限（LOQ）0.5 pg/mL，制备相关数据及标准曲线见表1、表2，图2、图3。

图2 阿奇霉素的标准曲线（高浓度加标区间）Fig.2 Preparation of azithromycin curves（high concentration standard interval）

表2 标准曲线制备（低浓度加标区间）Table 2 Preparation of standard curves（low concentration standard interval）

图3 阿奇霉素的标准曲线（低浓度加标区间）Fig.3 Preparation of azithromycin curves（low concentration standard interval）

2.3 方法学考察

2.3.1 回收率试验

在选定的HPLC MS/MS测定条件下，鸡可食组织的相对回收率见表3。

由表 3可知， 生鸡蛋在 0.05、0.20、0.50 μg/g添加水平时，分别是 78.86±2.87，83.26±2.72，87.12±2.15，回收率水平依次为生鸡蛋，生鸡肌肉，半熟鸡肉，鸡肉最低分别为 73.76±3.53，74.60±3.45，78.56±2.84。

表3 鸡可食组织中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 3 Chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

2.3.2 稳定性实验

日内和日间的变异系数（RSD）见表4、表5。

表4 日间鸡可食组织中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 4 Within-day chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

表5 鸡可食组织中日内和日间变异系数（n=5，%）Table 5 Chicken edible tissues within-day and between-day coefficient of variation（n=5， %）

由表知，生鸡蛋和生鸡肌肉的日间变异系数均大于日内的变异系数，而半熟鸡肉的日间与日内变异系数无规律；此外随着药物浓度的增加，各组织的变异系数普遍存在逐渐变小的趋势，表明稳定性与药物浓度存在正相关关系。

3 结论

本研究所得HPLC-MS/MS法检测阿奇霉素的主要色谱条件为：XDB-C18色谱柱（1.8 μm，2.1×30 mm）；以0.1%甲酸的水和甲醇（60∶40，体积比）作为流动相；流量为0.4mL/min；以MRM扫描模式，母离子m/z 749.5，定量离子m/z 589.5，定性离子m/z 157.8进行检测。确定0.001μg/mL的标准浓度为最低检测限（LOD），阿奇霉素组织在添加浓度为0.04 μg/g～0.80 μg/g 与0.80 μg/g～4.0 μg/g（相当于加标后进样浓度0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 与 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL）范围时，浓度与峰面积呈线性相关。采用本法测定鸡可食组织中阿奇霉素回收率在73.6%以上，日内日间变异系数均小于5%。结果还表明肉鸡可食组织中添加药物浓度越高，变异系数越小，稳定性越好。本方法前处理简单，出峰时间短，简单快速，检出限低，符合动物性食品中阿奇霉素残留量监控的需求。