荧光PCR技术批量快速筛查肠道致病菌混合样本的研究

吴桂芬等

[摘要] 目的 寻找从业人员肠道传染病菌的快速筛查技术方法。方法 以参加健康体检的从业人员作为研究对象，采集健康体检从业人员的肛拭子标本，采用荧光PCR技术批量快速筛查肠道致病菌混合样本的方法进行沙门氏菌和志贺氏菌检测，并与国家标准方法进行对照，比较两种检测方法的检出率结果。 结果 58 176份样本中，共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。荧光PCR对沙门菌和志贺氏菌的灵敏度达到了100%，特异性也保持在99%以上。结论 采用荧光PCR技术进行肠道致病菌的快速筛查能缩短检验时间，检验准确性高，从而有效阻断肠道传染病的传播和食物中毒的发生。

[关键词] 荧光PCR；肠道致病菌；快速筛查

[中图分类号] R446.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）07（c）-0181-02

[Abstract] Objective To find out a detection method for rapidly detecting the enteric pathogens in practitioners in food industry and public places. Methods The practitioners underwent healthy examination were selected as the subjects. And the anal swab specimens of them were collected. Fluorescent PCR method for rapidly detecting batch enteric pathogens mixed samples was used to detect the Salmonella and Shigella， and was compared with the national standard method. The detection rate of these two detection methods was compared. Results Of the 58176 samples， 52 samples with positive Salmonella were detected， the positive rate was 0.89‰， 51 samples with positive Shigella were detected， the positive rate was 0.88‰. A total 103 pathogenic bacteria were detected， the detection rate was 1.77‰. The sensitivity and specificity of the fluorescent PCR detection method for Salmonella and Shigella was 100% and 99%， respectively. Conclusion Fluorescent PCR method for rapidly detecting the enteric bacteria can shorten the detection time but with a high diagnostic accuracy， thereby effectively blocking the spread of intestinal infectious diseases and the incidence of food poisoning.

[Key words] Fluorescent PCR； Enteric pathogens； Rapid screening

我国法律规定，从事食品和公共场所的从业人员不能携带有伤寒、副伤寒和痢疾病原菌等[1]。为进一步探讨肠道致病菌的筛查检验方法，以缩短检验步骤，提高检验结果准确性，该研究选取2013年6—12月到该中心进行健康体检的从业人员肛拭子样本58 176份，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该中心进行健康体检的从业人员肛拭子样本58 176份，其中男性29 473人，女28 703人。采用荧光PCR技术批量快速筛查肠道致病菌混合样本的方法进行沙门氏菌和志贺氏菌检测。

1.2 检测方法

①采集方法。采用特定的环孔状肛拭采样器进行肛拭子样本采样。在进行采样时，将棉签插入肛齿线内3 cm左右，旋转3周后取出样本，然后将样本放入采样管中进行保管。各种细菌的增菌及分离所用试剂和培养基均为广东环凯微生物科技有限公司产品，细菌生化鉴定条法国生物梅里埃产品， 实时荧光PCR 检测试剂盒为深圳生科源技术有限公司产品，血清诊断试剂为宁波华润生物制品研究所产品。

②荧光PCR检测。首先将采集到的样本放入37 ℃的恒温箱中进行培养，时间在3～6 h。然后将每份培养后的标本取80 μL，每10份标本混合为1组[2]，然后进行混合，再加入20 μLDNA提取液进行充分混合，标本混合后做好编号、记录。然后抽取5 μL的混合标本加入8联PCR反应管内。并对所抽取的标本进行5 min的离心。此时8联PCR反应管有8份混合标本，实际代表了80份的标本[3]。然后将反应管中的标本置于荧光PCR仪上进行检测。

③对所有样本同时以传统分离培养方法作为“金标准”进行检验[4]。

1.3 观察指标

①荧光PCR技术检测结果判断；②对比荧光PCR技术检验和“金标准”的检测速度、灵敏度和特异性。endprint

1.4 统计方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，用（x±s）表示。

2 结果

2.1 荧光PCR技术中阳性检测情况

58 176份从业人员肛拭子样本的检测结果中，共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。见见表1。

3 讨论

随着科技的进步，医疗诊断技术的完善，检测技术的快速化、自动化、准确化已经成为各类检测方法的发展趋势[5]，而对于从业人员肠道致病菌的检查更是关系到食品卫生安全，更应该受到更多的关注。

荧光PCR技术用于从业人员体检肠道致病菌快速检测，其具有高灵敏性和高准确性，能够提高致病菌的阳性检出率[6]，从而有利于防止疾病的传播。

利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检测简单、快速，可以在4～5 h内完成肛拭子样本的初步筛查，并且可以排除隐形标本，可以在第2个工作日完成，第3个工作日就可以领取相应健康证明[7]，而以传统分离培养方法的“金标准”则在第4个工作日时才能完成检验[8]，且操作程序复杂，主观影响因素较大，极易产生检测误差，影响检测结果[9]。采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检验时间。另外，荧光PCR技术可以显著减少后期细菌的培养以及鉴定工作程序，提高阳性检出率[10]，在整个操作环境中尽量避免了对试验器具的重复利用，从而降低了标本被污染的风险，使得检验结果更加客观、准确。我国食品从业人员较多，如果普遍采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检查时间[11]，及时发现疾病的传染源，从而控制传染源、切断传播途径[12]，防止传染病的传播流行，同时，也可防止传染病菌携带者污染食物，防止食物中毒的发生，具有极大的社会效益。

该研究中共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。在灵敏度与特异性比较方面，荧光PCR对沙门菌和志贺氏菌的灵敏度达到了100%，特异性也保持在99%以上，说明利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检验能有效节省检测时间，检验准确性高，值得临床推广应用。与传统方法相比，荧光PCR存在着独特的优势和特点， PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能[13]，最近研究报道[14]，其最低可检测含10个霍乱弧菌的样本，国内多数检测试剂盒可检测102拷贝的病原体核酸。但同时也应意识到PCR检测技术中存在的局限性[15]，在试验操作过程中规范操作方法和操作路径，严格样本采集程序，从而使得样本检测结果更加准确、科学。

研究认为如能恰当采用荧光法应用于肠道致病菌检测，将产生巨大的社会效益和经济效益。由于实时荧光方法操作简便，有规范的作业指导，具有推广应用价值。

[参考文献]

[1] 马淑贞，周卓晟，石晓路. 应用实时荧光PCR法快速检测从业体检人群肠道致病菌结果分析[J].热带医学杂志，2013，13（11）：1412-1414.

[2] 汪武新，韦炳扬，刘海文，等.荧光PCR快速检测从业人员肠道致病菌结果分析[J].中国热带医学，2011，11（8）：971-972.

[3] 曾斤日，刘爱民，彭守柏. 实时PCR筛查、培养法确认方案在从业人员肠道致病菌检测的研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1711-1713.

[4] 王琳，江鹏飞，李贻汉，等. 荧光PCR在基层从业人员带菌检测中应用的可行性评价[J].中国卫生检验杂志，2013，12（3）：664-666.

[5] 吴海娟. 实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析[J].现代预防医学，2013，22（12）：2323-2325.

[6] 邱亚群，扈庆华，汪武新，等. 荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价[J].中国热带医学，2009，9（1）：12-13.

[7] 侯宇.荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].贵州农业科学，2009，13（6）：29-32，35.

[8] 陈贤革.荧光PCR技术应用的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，11（2）：162-164.

[9] 陈旭，齐凤坤，康立功，等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报，2010，9（8）：148-155.

[10] 施林祥，李东辉. 实时荧光PCR研究新进展[J].世界华人消化杂志，2009，12（5）：596-599.

[11] 高斌，刘敬忠. 实时荧光PCR技术的研究及其应用进展[J].诊断学理论与实践，2010，10（6）：507-509.

[12] 徐胜玲，蔡师志，汤国球.服务行业从业人员肠道沙门氏菌检测结果分析[J].热带医学杂志，2010，6（9）：108-109.

[13] 曹玮，王明忠，王晓英，等. 核酸检测及相关技术在食源性致病菌快速检测中的研究[J]. 卫生研究， 2008， 37（2）： 245-248.

[14] Gubala AJ， Proll DF. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae[J]. Applied and environmental microbiology， 2006， 72（9）： 6424-6428.

[15] 朱文斯，黄茜华，黄艳兰，等. 含内标的荧光PCR—荧光定量PCR[J]. 中国医药导刊，2011，12（4）：309-310，302.

（收稿日期：2014-04-28）endprint

1.4 统计方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，用（x±s）表示。

2 结果

2.1 荧光PCR技术中阳性检测情况

58 176份从业人员肛拭子样本的检测结果中，共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。见见表1。

3 讨论

随着科技的进步，医疗诊断技术的完善，检测技术的快速化、自动化、准确化已经成为各类检测方法的发展趋势[5]，而对于从业人员肠道致病菌的检查更是关系到食品卫生安全，更应该受到更多的关注。

荧光PCR技术用于从业人员体检肠道致病菌快速检测，其具有高灵敏性和高准确性，能够提高致病菌的阳性检出率[6]，从而有利于防止疾病的传播。

利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检测简单、快速，可以在4～5 h内完成肛拭子样本的初步筛查，并且可以排除隐形标本，可以在第2个工作日完成，第3个工作日就可以领取相应健康证明[7]，而以传统分离培养方法的“金标准”则在第4个工作日时才能完成检验[8]，且操作程序复杂，主观影响因素较大，极易产生检测误差，影响检测结果[9]。采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检验时间。另外，荧光PCR技术可以显著减少后期细菌的培养以及鉴定工作程序，提高阳性检出率[10]，在整个操作环境中尽量避免了对试验器具的重复利用，从而降低了标本被污染的风险，使得检验结果更加客观、准确。我国食品从业人员较多，如果普遍采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检查时间[11]，及时发现疾病的传染源，从而控制传染源、切断传播途径[12]，防止传染病的传播流行，同时，也可防止传染病菌携带者污染食物，防止食物中毒的发生，具有极大的社会效益。

该研究中共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。在灵敏度与特异性比较方面，荧光PCR对沙门菌和志贺氏菌的灵敏度达到了100%，特异性也保持在99%以上，说明利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检验能有效节省检测时间，检验准确性高，值得临床推广应用。与传统方法相比，荧光PCR存在着独特的优势和特点， PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能[13]，最近研究报道[14]，其最低可检测含10个霍乱弧菌的样本，国内多数检测试剂盒可检测102拷贝的病原体核酸。但同时也应意识到PCR检测技术中存在的局限性[15]，在试验操作过程中规范操作方法和操作路径，严格样本采集程序，从而使得样本检测结果更加准确、科学。

研究认为如能恰当采用荧光法应用于肠道致病菌检测，将产生巨大的社会效益和经济效益。由于实时荧光方法操作简便，有规范的作业指导，具有推广应用价值。

[参考文献]

[1] 马淑贞，周卓晟，石晓路. 应用实时荧光PCR法快速检测从业体检人群肠道致病菌结果分析[J].热带医学杂志，2013，13（11）：1412-1414.

[2] 汪武新，韦炳扬，刘海文，等.荧光PCR快速检测从业人员肠道致病菌结果分析[J].中国热带医学，2011，11（8）：971-972.

[3] 曾斤日，刘爱民，彭守柏. 实时PCR筛查、培养法确认方案在从业人员肠道致病菌检测的研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1711-1713.

[4] 王琳，江鹏飞，李贻汉，等. 荧光PCR在基层从业人员带菌检测中应用的可行性评价[J].中国卫生检验杂志，2013，12（3）：664-666.

[5] 吴海娟. 实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析[J].现代预防医学，2013，22（12）：2323-2325.

[6] 邱亚群，扈庆华，汪武新，等. 荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价[J].中国热带医学，2009，9（1）：12-13.

[7] 侯宇.荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].贵州农业科学，2009，13（6）：29-32，35.

[8] 陈贤革.荧光PCR技术应用的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，11（2）：162-164.

[9] 陈旭，齐凤坤，康立功，等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报，2010，9（8）：148-155.

[10] 施林祥，李东辉. 实时荧光PCR研究新进展[J].世界华人消化杂志，2009，12（5）：596-599.

[11] 高斌，刘敬忠. 实时荧光PCR技术的研究及其应用进展[J].诊断学理论与实践，2010，10（6）：507-509.

[12] 徐胜玲，蔡师志，汤国球.服务行业从业人员肠道沙门氏菌检测结果分析[J].热带医学杂志，2010，6（9）：108-109.

[13] 曹玮，王明忠，王晓英，等. 核酸检测及相关技术在食源性致病菌快速检测中的研究[J]. 卫生研究， 2008， 37（2）： 245-248.

[14] Gubala AJ， Proll DF. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae[J]. Applied and environmental microbiology， 2006， 72（9）： 6424-6428.

[15] 朱文斯，黄茜华，黄艳兰，等. 含内标的荧光PCR—荧光定量PCR[J]. 中国医药导刊，2011，12（4）：309-310，302.

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1.4 统计方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，用（x±s）表示。

2 结果

2.1 荧光PCR技术中阳性检测情况

58 176份从业人员肛拭子样本的检测结果中，共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。见见表1。

3 讨论

随着科技的进步，医疗诊断技术的完善，检测技术的快速化、自动化、准确化已经成为各类检测方法的发展趋势[5]，而对于从业人员肠道致病菌的检查更是关系到食品卫生安全，更应该受到更多的关注。

荧光PCR技术用于从业人员体检肠道致病菌快速检测，其具有高灵敏性和高准确性，能够提高致病菌的阳性检出率[6]，从而有利于防止疾病的传播。

利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检测简单、快速，可以在4～5 h内完成肛拭子样本的初步筛查，并且可以排除隐形标本，可以在第2个工作日完成，第3个工作日就可以领取相应健康证明[7]，而以传统分离培养方法的“金标准”则在第4个工作日时才能完成检验[8]，且操作程序复杂，主观影响因素较大，极易产生检测误差，影响检测结果[9]。采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检验时间。另外，荧光PCR技术可以显著减少后期细菌的培养以及鉴定工作程序，提高阳性检出率[10]，在整个操作环境中尽量避免了对试验器具的重复利用，从而降低了标本被污染的风险，使得检验结果更加客观、准确。我国食品从业人员较多，如果普遍采用荧光PCR技术进行检查，可以有效缩短检查时间[11]，及时发现疾病的传染源，从而控制传染源、切断传播途径[12]，防止传染病的传播流行，同时，也可防止传染病菌携带者污染食物，防止食物中毒的发生，具有极大的社会效益。

该研究中共检出52份沙门菌阳性标本，阳性率为0.89‰，检出51份志贺氏菌阳性标本，阳性率为0.88‰。合计共检出致病菌103份，检出率为1.77‰。在灵敏度与特异性比较方面，荧光PCR对沙门菌和志贺氏菌的灵敏度达到了100%，特异性也保持在99%以上，说明利用荧光PCR技术进行肠道致病菌的检验能有效节省检测时间，检验准确性高，值得临床推广应用。与传统方法相比，荧光PCR存在着独特的优势和特点， PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能[13]，最近研究报道[14]，其最低可检测含10个霍乱弧菌的样本，国内多数检测试剂盒可检测102拷贝的病原体核酸。但同时也应意识到PCR检测技术中存在的局限性[15]，在试验操作过程中规范操作方法和操作路径，严格样本采集程序，从而使得样本检测结果更加准确、科学。

研究认为如能恰当采用荧光法应用于肠道致病菌检测，将产生巨大的社会效益和经济效益。由于实时荧光方法操作简便，有规范的作业指导，具有推广应用价值。

[参考文献]

[1] 马淑贞，周卓晟，石晓路. 应用实时荧光PCR法快速检测从业体检人群肠道致病菌结果分析[J].热带医学杂志，2013，13（11）：1412-1414.

[2] 汪武新，韦炳扬，刘海文，等.荧光PCR快速检测从业人员肠道致病菌结果分析[J].中国热带医学，2011，11（8）：971-972.

[3] 曾斤日，刘爱民，彭守柏. 实时PCR筛查、培养法确认方案在从业人员肠道致病菌检测的研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1711-1713.

[4] 王琳，江鹏飞，李贻汉，等. 荧光PCR在基层从业人员带菌检测中应用的可行性评价[J].中国卫生检验杂志，2013，12（3）：664-666.

[5] 吴海娟. 实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析[J].现代预防医学，2013，22（12）：2323-2325.

[6] 邱亚群，扈庆华，汪武新，等. 荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价[J].中国热带医学，2009，9（1）：12-13.

[7] 侯宇.荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].贵州农业科学，2009，13（6）：29-32，35.

[8] 陈贤革.荧光PCR技术应用的研究进展[J].畜牧与饲料科学，2010，11（2）：162-164.

[9] 陈旭，齐凤坤，康立功，等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报，2010，9（8）：148-155.

[10] 施林祥，李东辉. 实时荧光PCR研究新进展[J].世界华人消化杂志，2009，12（5）：596-599.

[11] 高斌，刘敬忠. 实时荧光PCR技术的研究及其应用进展[J].诊断学理论与实践，2010，10（6）：507-509.

[12] 徐胜玲，蔡师志，汤国球.服务行业从业人员肠道沙门氏菌检测结果分析[J].热带医学杂志，2010，6（9）：108-109.

[13] 曹玮，王明忠，王晓英，等. 核酸检测及相关技术在食源性致病菌快速检测中的研究[J]. 卫生研究， 2008， 37（2）： 245-248.

[14] Gubala AJ， Proll DF. Molecular-beacon multiplex real-time PCR assay for detection of Vibrio cholerae[J]. Applied and environmental microbiology， 2006， 72（9）： 6424-6428.

[15] 朱文斯，黄茜华，黄艳兰，等. 含内标的荧光PCR—荧光定量PCR[J]. 中国医药导刊，2011，12（4）：309-310，302.

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