8种生物杀菌剂对草莓枯萎病菌室内抑菌活性的测定

吉沐祥等

摘要：为探明生物杀菌剂对草莓枯萎病菌的室内抑菌活性，采用菌丝生长速率法测定了8种生物杀菌剂对草莓枯萎病的室内抑菌活性。结果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷类抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井冈霉素、春雷霉素对草莓枯萎病菌的EC50分别为0.790 2、5.256 9、6.911 0、10.855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。草莓枯萎病菌对8种生物杀菌剂的敏感性差异较大，供试草莓枯萎病菌对申嗪霉素最敏感，其次为寡雄腐霉。

关键词：草莓枯萎病菌；生物杀菌剂；抑菌活性

中图分类号： S436.67+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0103-03

收稿日期：2014-06-15

基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2012378）；江苏省“六大人才高峰”项目（编号：2013-NY-001）；江苏省镇江市农业科技支撑计划（编号：NY2013014）。

作者简介：吉沐祥（1963—），男，江苏宝应人，研究员，主要从事植保农药研究与开发。E-mail：jilvdun2800@163.com。

通信作者：李国平，研究员。E-mail：jrlgp@126.com。草莓（Fragaria ananassa Duch）以其果实柔软多汁、味道鲜美、营养丰富、生育期短、结果早和产量高等特点备受人们喜爱，在国际市场上具有重要的经济地位[1]。草莓枯萎病病原为尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f.sp. fragariae），只危害草莓，是重要的土传病害。该病导致草莓根系坏死，生长不良，矮小衰弱，叶无光泽，下部叶片变紫红色萎蔫状，叶柄和果梗的维管束变褐色或黑褐色，最后全株枯死。轻病株则结果减少，果实不能正常膨大，品质低劣。病菌在寄主病残体内以菌丝体或厚垣孢子或拟菌核在土壤中越冬，或在病残体、混有病残体的堆肥、种子内外越冬，一般可存活6～8年，带菌土壤是病害侵染的主要来源。环境条件适宜时，病菌借助带病母株、土壤、水源、农具等进行传播，从植株根部伤口或直接从幼根的表皮和根毛侵入，在植株维管束内繁殖，不断扩散到植株叶及根系，引起植株系统性发病，最后干枯死亡。病菌喜温暖潮湿环境，发病最适宜气候条件为25～28 ℃，相对湿度60%～85%。草莓枯萎病的发病盛期在育苗中后期、假植期、定植初期。草莓枯萎病危害性大，是顽固性土传病害，土壤通透性差、过干过湿、多年连作、氮肥过多或有线虫危害的地块易导致枯萎病的严重发生[2]。

目前，草莓枯萎病的防治有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等方法。农业防治包括作物轮作、移栽脱毒种苗、选育抗病品种以及高架基质栽培等，由于提高了劳动强度、生产成本，或因解除连作障碍的效果不佳等因素，还没有在草莓种植中广泛应用。物理防治方法主要是利用高温土壤消毒技术，如袁会珠等采用室外小区试验方法，在草莓栽培过程中利用客土法、人工基质法、太阳能土壤消毒方法防治草莓土传病害，3种防治方法增产幅度分别高达100%、115%、129%，与溴甲烷土壤消毒差别不大，基本可以替代溴甲烷土壤消毒技术，但该类方法存在劳动强度大和严重环境污染问题[3]。随着化学防治导致病原菌抗药性、农药残留等问题日益加重，生态环境和食品安全受到威胁，因而环境友好型生物农药是化学农药的最佳替代产品。本研究采用菌丝生长速率法分别测定了8种生物杀菌剂对草莓枯萎病菌的室内毒力，并进行了防治草莓枯萎病的室内盆栽试验，以期为草莓枯萎病的防治和新型生物药剂的研发提供技术依据。

1材料与方法

1.1培养基

马铃薯培养基（PDA）[4]，用于草莓枯萎病菌的分离、保存以及毒力测定。

1.2菌株

草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae），采自镇江市句容草莓园，由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所现代农业研究室分离、鉴定，按照柯郝法则（Kochs rule）[5]验证后保存备用。菌株保存于PDA斜面上（4 ℃）。

1.3药剂

90%乙蒜素（ethylicin），开封大地农化生物科技有限公司生产；67.1%井冈霉素（Jinggangmycin），杭州正诚农化有限公司生产；65%春雷霉素（kasugamycin），华北制药股份有限公司生产；95%申嗪霉素（phenazine-1-carboxylic acid），上海农乐生物制品股份有限公司生产；80%氨基寡糖素（oligosaccharins），潍坊华诺生物科技有限公司生产；3%超敏蛋白（harpin protein），江苏省农垦生物化学有限公司生产；1.0×106个孢子/g寡雄腐霉（pythium oligandrum），捷克生物制剂有限公司生产；4%嘧啶核苷类抗菌素（pyrimidine nucleoside antibiotics），武汉科诺生物有限公司生产。

1.4仪器设备

电子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培养箱、直径为 75 mm 的培养皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接种刀等。

1.5试验方法

1.5.1药液的配制及浓度设计母液配制：将90%乙蒜素和95%申嗪霉素分别用适量丙酮溶解并加入10%的吐温-80，其他药剂分别用适量无菌水溶解，各药剂均配制成 1 000 μg/mL 的母液置于4 ℃冰箱中备用。

不同药剂在含药PDA培养基中的浓度设计均为：0.781 25～100.000 00 μg/mL，共8个梯度浓度（表1）。除母液外所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。

1.5.2敏感性检测采用菌丝生长速率法[6]，将保留的草莓枯萎病菌转接到PDA平皿中，在25 ℃下活化96 h，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到1.4倍比稀释配制的含药和空白对照的PDA平皿中，25 ℃培养96 h，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。

计算菌落直径均值，按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率。菌丝生长平均抑制率=[（对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）/（对照菌落直径均值-接种菌饼直径）]×100%。采用DPS 13.0专业版数据处理系统，计算出各药剂对草莓枯萎病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95%置信限，并以最敏感药剂的EC50值为对照求出相对毒力指数。

2结果与分析

2.1不同生物杀菌剂对草莓枯萎病菌丝生长的影响

2.2草莓枯萎病菌对不同生物杀菌剂敏感性的比较

敏感性检测结果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷类抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井冈霉素、春雷霉素对草莓枯萎病菌的EC50值分别为0.790 2、5.256 9、6.911 0、10855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。8种供试生物杀菌剂中，申嗪霉素对草莓枯萎病菌菌丝生长的抑制活性最强，而春雷霉素的抑制活性最低，二者EC50值相差约34.7939 μg/mL。以申嗪霉素的EC50值为对照得出了不同杀菌剂相对毒力指数，寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷类抗菌素的相对毒力指数分别为6.65、8.75、13.74；乙蒜素、氨基寡糖素、井冈霉素、春雷霉素的相对毒力指数在34～46之间（表2）。表明我国自主开发的抗生素类生物杀菌剂——申嗪霉素对供试草莓枯萎病菌的抑制活性最强；寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷类抗菌素对草莓枯萎病菌的抑制活性较强；而井冈霉素和春雷霉素等生物杀菌剂对草莓枯萎病菌的抑制活性相对较弱。表2草莓枯萎病菌对8种生物杀菌剂的敏感性检测结果

3结论与讨论

草莓连作障碍问题、草莓枯萎病的防治一直以来都引起了各级植保部门的高度关注。由于草莓为多年生植物，在同块地里连续多年种植后，致使土壤中病菌大量积累，加上品种抗病性下降、田间管理不善等影响因素，导致草莓枯萎病发病率逐年加重。目前，在抗草莓枯萎病品种缺乏的情况下，选择适当药剂并采用合适的施药方法是防治草莓枯萎病的重要措施。生物防治是防治草莓土传病害，解除草莓连作障碍技术研究的热点。王占武等以拮抗细菌B501在草莓根际进行定植防治草莓黄萎病，连续2年的田间防效分别达到了939%、968%[7]。马宝红等利用VAM 菌根菌（Glomus mosseae 和Glomus versiforme），对草莓有促生、防黄萎病的效果[8]。冯玉龙等利用拮抗芽孢杆菌发酵液的硫酸铵沉淀物来防治草莓黄萎病[9]。徐淑华等利用2株拮抗细菌和多种植物提取物防治草莓黄萎病，并取得初步成效[10]。甄文超等利用药用植物源土壤添加物控制草莓再植病害，针对草莓再植病害的3种主要病原菌：Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum和Verticillium dahliae筛选了125种药用植物腐解物提取液具有抑菌活性，并证明川芎和苦参的等量混合物有望用于草莓黄萎病害的防治[11]。赵秀娟等从草莓根围分离的拮抗细菌发酵液对草莓重茬病害有一定防效[12]。宋志伟等用1种复合微生物制剂对草莓黄萎病的田间防效达76.9%～846%[13]。Vosatka 等用AMF （Arbuscular micorrhizal fungi） 和Pseudomonas putida同时接种草莓根际土壤发现，它们具有增效互作作用[14]；利用Agrobacterium radiobacter能够促进AMF 在草莓根际定殖[15]。Porras等利用太阳能土壤消毒和木霉菌剂结合的方法，明确了在太阳高温消毒后再添加生物菌剂的方法，2年防效达84.5%[16]。但在当前的草莓生产中，防治草莓枯萎病等土传病害，仍缺乏高效稳定的生防制剂。

本研究采用菌丝生长速率法测定了草莓枯萎病菌对寡雄腐霉、嘧啶核苷类抗菌素、春雷霉素，井冈霉素、超敏蛋白、乙蒜素、申嗪霉素、氨基寡糖素8种生物杀菌剂的室内毒力。结果表明，8种生物杀菌剂的毒力大小顺序为申嗪霉素>寡雄腐霉>超敏蛋白>嘧啶核苷类抗菌素>乙蒜素>氨基寡糖素>井冈霉素>春雷霉素。申嗪霉素为我国自主开发的抗生素类生物杀菌剂，是由荧光假单胞菌菌株M18经发酵、提取而成，对西瓜枯萎病、辣椒疫病等土传病害有良好的防治效果[17]，本研究中申嗪霉素对草莓枯萎病菌菌丝生长的抑制活性最强，表明该药剂具有较好的应用前景。本研究仅进行了杀菌剂的室内筛选，还有待于在田间开展药剂防治试验，同时还需进一步研究各类药剂的应用技术，确保草莓的绿色无公害生产。

参考文献：

[1]贾冬梅. 大棚草莓的主要病害及防治[J]. 河北果树，2000（1）：38.

[2]邱强，胡淼，王志田. 原色西瓜甜瓜草莓病虫与营养诊断图谱[M]. 北京：中国科学技术出版社，1996：89-90.

[3]Mass J L. Compendium of strawberry disease[M]. Minnesota：American Phytopathological Society，1998.

[4]赵斌，何绍江. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2002：251.

[5]宗兆锋，康振生. 植物病理学原理[M]. 北京：中国农业出版社，2002：244-245.

[6]Schwinn F. Recommended methods for the detection and measurement of resistance of plant pathogens to fungicides：method for fungicide resistance in Tate blight of potato[J]. Plant Protection Bulletin，1982，30：69-71.

[7]王占武，李晓芝，葛建国，等. 拮抗菌B501在草莓根际的定殖及对其他根际微生物的影响[J]. 河北农业科学，2002，6（3）：14-18.

[8]马宝红，甄文超，曹克强，等. VAM真菌对草莓促生、防草莓黄萎病效应初探[J]. 河北农业大学学报，2004，27（4）：71-73.

[9]冯玉龙，阳丽，王银定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北农业大学学报，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑华，蒋继志，姚克文，等. 两株拮抗细菌对草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北农业大学学报，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克强，代丽，等. 利用药用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（4）：730-735.

[12]赵秀娟，徐文桥，张凤巧，等. 土壤拮抗微生物对几种草莓病原菌的拮抗作用测试[J]. 中国农业科技导报，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志伟，陈世昌，王小琳，等. 复合微生物制剂对重茬草莓生长及产量品质的影响研究[J]. 土壤通报，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新农药介绍[J]. 农药科学与管理，2007，28（5）：60.张斌，梁雪杰，乔俊卿，等. 29种常用杀菌剂对番茄枯萎病菌和青枯病菌的室内毒力测定[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：106-109.

[7]王占武，李晓芝，葛建国，等. 拮抗菌B501在草莓根际的定殖及对其他根际微生物的影响[J]. 河北农业科学，2002，6（3）：14-18.

[8]马宝红，甄文超，曹克强，等. VAM真菌对草莓促生、防草莓黄萎病效应初探[J]. 河北农业大学学报，2004，27（4）：71-73.

[9]冯玉龙，阳丽，王银定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北农业大学学报，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑华，蒋继志，姚克文，等. 两株拮抗细菌对草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北农业大学学报，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克强，代丽，等. 利用药用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（4）：730-735.

[12]赵秀娟，徐文桥，张凤巧，等. 土壤拮抗微生物对几种草莓病原菌的拮抗作用测试[J]. 中国农业科技导报，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志伟，陈世昌，王小琳，等. 复合微生物制剂对重茬草莓生长及产量品质的影响研究[J]. 土壤通报，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新农药介绍[J]. 农药科学与管理，2007，28（5）：60.张斌，梁雪杰，乔俊卿，等. 29种常用杀菌剂对番茄枯萎病菌和青枯病菌的室内毒力测定[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：106-109.

[7]王占武，李晓芝，葛建国，等. 拮抗菌B501在草莓根际的定殖及对其他根际微生物的影响[J]. 河北农业科学，2002，6（3）：14-18.

[8]马宝红，甄文超，曹克强，等. VAM真菌对草莓促生、防草莓黄萎病效应初探[J]. 河北农业大学学报，2004，27（4）：71-73.

[9]冯玉龙，阳丽，王银定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北农业大学学报，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑华，蒋继志，姚克文，等. 两株拮抗细菌对草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北农业大学学报，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克强，代丽，等. 利用药用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（4）：730-735.

[12]赵秀娟，徐文桥，张凤巧，等. 土壤拮抗微生物对几种草莓病原菌的拮抗作用测试[J]. 中国农业科技导报，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志伟，陈世昌，王小琳，等. 复合微生物制剂对重茬草莓生长及产量品质的影响研究[J]. 土壤通报，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新农药介绍[J]. 农药科学与管理，2007，28（5）：60.张斌，梁雪杰，乔俊卿，等. 29种常用杀菌剂对番茄枯萎病菌和青枯病菌的室内毒力测定[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：106-109.