森林脑炎灭活疫苗稳定性检定

费刚 郭新

森林脑炎是我国东北林区的一种自然疫源性疾病, 传播媒介为一种寄生于林中野生脊椎动物, 特别是啮齿类动物的嗜血昆虫——森林硬蜱, 在春夏季蜱活动高峰期受到蜱叮咬而感染森林脑炎病毒导致患病, 称森林脑炎病。我国森林脑炎属于远东型, 患病以中枢神经系统为主要特征, 有头痛、恶心、羞明、惊厥、轻瘫为主, 死亡率约为30%, 康复者中约30%～60%有后遗症。森林脑炎灭活疫苗系用森林脑炎(简称森脑)病毒“森张”株接种于地鼠肾单层细胞培养后收获病毒液, 加入甲醛溶液将病毒灭活后制成, 用于预防森林脑炎。目前, 国家规定森林脑炎灭活疫苗有效期限为21个月,储存条件为2～8℃避光保存和运输。作者检测了森林脑炎灭活疫苗在规定储存条件下超过有效期12个月效价稳定性和其它检定项目。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 森林脑炎灭活疫苗 生产日期2007年09月11日,有效期2009月08月27日(超过有效期12个月)。

1.1.2 稀释液 为pH(7.8±0.2)的种子液。

1.1.3 攻击检品毒 毒力为lgLD50/1.0 ml≥9.0的森林脑炎毒种P10代。

1.1.4 试验动物 体重为10～12 g清洁级小白鼠。

1.2 方法效价测定［1］：将供试品腹腔免疫体重10～12 g小鼠30只, 免疫2次, 间隔7 d, 每只小鼠每次腹腔注射0.3 ml, 另取同批小鼠30只作为空白对照。初次免疫后第14 d以适宜稀释度的“森张”株病毒悬液分别进行小鼠腹腔攻击, 每个病毒稀释度分别攻击6只, 每只0.3 ml。攻击后3 d内死亡者不计(动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%), 观察21 d判定结果。对照组病毒滴度应不低于7.51 g LD50/0.3 ml, 免疫保护指数应>5.0×105。

2 结果

2.1 超过规定有效期12个月疫苗效价的稳定性 森林疫苗免疫小白鼠后就可使小白鼠产生免疫力, 从而抑制森林脑炎病毒对小白鼠的感染, 通过计算免疫疫苗组(试验组)和未免疫组(对照组)在森林脑炎病毒液攻击下的半数致死剂量,依Reed-Muech氏法计算效力保护指数, 以判定疫苗是否合格和有效性, 亦可判定该疫苗是否为森林脑炎灭活疫苗［2］。超过规定有效期12个月疫苗效价的稳定性仍保持在国家药品标准的合格水平之上, 表明森脑的稳定性良好。

2.2 试验组具体数据见表1。

表1 超过规定有效期12个月试验组疫苗效价的稳定性

表1可见, 由此病毒能致半数动物死亡的稀释度介于10-2～10-3之间, 计算方法如下

{高于50%的死亡百分数-(50%)}/{高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数}=距离比例 {75%-50%}/{75%-25%}=0.50；低稀释度的反对数(高于50%死亡率)=-2；距离比例(0.5)×稀释因数(对数10)=-0.5；LD50滴度(试)=-2.5 LD50(试)=2.5

2.3 对照组具体数据见表2。

表2 超过规定有效期12个月对照组疫苗效价的稳定性

表2可见, 由此病毒能致半数动物死亡的稀释度介于10-8～10-9之间, 计算方法如下

{高于50%的死亡百分数-(50%)}/{高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数}=距离比例 {100%-50%}/{100%-17%}=0.60；低稀释度的反对数(高于50%死亡率)=-8；距离比例(0.6)×稀释因数(对数10)=-0.60；LD50滴度(对)=-8.60 LD50(对)=8.60；对照组lgLD50/0.3 ml=8.60>7.5, 试验成立。

2.4 保护指数计算方法 对照组lgLD50/0.3ml=8.60, 试验组lgLD50/0.3ml=2.5 对照组lgLD50/0.3ml-试验组lgLD50/0.3ml=6.10 免疫保护指数106.10=12.6×105>5×105, 试验成立。

3 其他检定项目

按照中国药典(2010版)的检定程序分别对药品鉴别试验、外观、装量、pH值、游离甲醛含量、硫柳汞含量、氢氧化铝含量、热稳定性试验、异常毒性检查、细菌内毒素检查等项目进行检定, 结果均合格。

4 讨论

森脑疫苗已被临床使用多年, 但关于其保存期限与稳定性之间的关系鲜有报道。本试验的目的在于检验森脑疫苗在规定储存期限之外的稳定性, 为生产运输和使用该制剂提供试验依据。森脑疫苗是一种预防性制品, 因生产周期长, 国家规定的有效期较短(21个月), 是必造成市场供需方面的矛盾。造成供求不畅和制品报废增加, 造成一定经济损失。若将制品有效期限延长12个月, 定为33个月, 可有利于解决上述问题。作者连续三批试验, 其结果相同。为支持森脑疫苗制品有效期限延长提供一定的参考价值。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部).北京:中国医药科技出版社, 2010: 95.

［2］森林脑炎灭活疫苗企业注册标准(WS4-(S-003)-2008Z).