一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

刘慰+秦浩+刘霜+等

摘要以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象，通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定，该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis，命名为HX08，并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库，获得登陆号KF774302.通过生测发现，HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究，建立了HPLC技术分离体系，使用H2O做流动相，以0.5 mL/min 流速洗脱，检测波长分别为215、254和280 nm，收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDSPAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解，利用质谱（ LTQMS） 技术进行了分子特性分析，鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.

关键词枯草芽胞杆菌；菌株鉴定；生理生化特性；杀虫活性

中图分类号S476文献标识码A文章编号10002537（2014）05001407

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）具有典型的芽胞杆菌特征，是一类好氧、内生抗逆孢子的杆状细菌[1]，作为一种有益的土壤细菌，对人畜相对安全，发达的分泌系统和抗逆生长的孢子都让其对多种病原菌产生拮抗作用[2].枯草芽胞杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，所筛得的拮抗菌株数量也较多，但是应用到杀虫方面的菌株较少，潜力有待发掘[3].鉴于目前农作物生产中存在的病虫害防治问题，本研究从本地农业生产实际出发，力求获得适合本地区的对鳞翅目害虫具有高效杀虫活性的枯草芽胞杆菌，为开发该菌的生物防治功能和扩大农作物应用范围奠定基础.

3讨论

根据该菌在平板上的菌落形态，初步推断为芽胞杆菌类，故采用高温法筛选，优化了菌株的分离过程，提高了分离效率.本研究通过一系列方法，对从湖南长沙市采集到的土样中利用高温条件筛选到的219株芽胞杆菌中，分离得到一株新菌株并进行了鉴定和归类.将测得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜寻，该株菌与Bacillus subtilis strain CU12（JX489167.1）具有很高相似性，序列相似性为99%，可认为属于枯草芽胞杆菌中一个新的菌株（HX08）.

研究发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在低pH环境下也可以诱导合成草酸脱羧酶[78]，枯草芽胞杆菌生防菌株Bs916 可产生抗菌蛋白对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum） 和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani） 的菌丝生长具有明显的抑制作用，随后鉴定该蛋白为草酸脱羧酶[910].该酶单体结构含有2个结构相似的cupin结构域， 并且在每个域的中心部位含有一个金属结合位点， 和周围的氨基酸残基结合成为双核中心， 另外它的N末端还含有短螺旋突出肽链[8]，该酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在结构域II的结合位点上[1116]，本研究分离出的活性物质的具体杀虫机理需要进一步深入研究.HX08菌株60 h的发酵液杀虫效果更为明显，说明进入生长稳定期后菌株的杀虫活性物质仍然继续增加，能提高杀虫效果.鉴于目前市场很少有能有效防治鳞翅目害虫的枯草芽胞杆菌微生物制剂[1718]，本实验分离出对棉铃虫等鳞翅目害虫有致死毒力的杀虫菌株，对研究草酸脱羧酶杀虫作用分子机制及研发新型杀虫剂提供了重要基础，为生态农业和绿色农产品产业发展提供支撑.

参考文献：

[1]刘志恒.现代微生物学[M].北京：科学出版社， 2002.

[2]李明，双宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报， 2009，40（9）：111114.

[3]程洪斌，刘晓桥，陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展[J].上海农业学报， 2006，22（1）：109112.

[4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技， 2012（3）：118119.

[5]曹茂新，洪枫，朱利民.草酸脱羧酶及其应用[J].中国生物工程杂志， 2005 ，25（Z）：170175.

[6]LIU Y， CHEN Z， NG T B， et al. Bacisubin， an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B916[J]. Peptides， 2007，28（3）：553559.

[7]刘永锋，陈志谊，周明国，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 的抑菌活性及其抑菌物质初探[J]. 农药学学报， 2007，9（1）：92954.

[8]于俊杰，陈志谊，胡建坤，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 草酸脱羧酶基因Bacisubin 的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析[J].江苏农业学报， 2012，28（3）：497502.

[9]李林珂，高玉千，崔锦，等. 一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J]. 河南农业科学， 2006（3）：5052.

[10]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 1999：370384.

[11]BANERJEE A B， BOSE S K. Aminoacid configuration of mycobacillin[J]. Nature， 1963，200：471.

[12]TAMEHIRO N ， OKAMOTO Y， OKAMOTO S， et al. Bacilysocin， a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Antimicrob agents chemother， 2002，46：315320.

[13]沈锦玉，尹文林，曹铮，等.枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质[J].水生生物学报， 2005，29（6）：689693.

[14]白延琴，辛小玲， 来有志，等.枯草芽孢杆菌的分离筛选[J].畜牧兽医杂志， 2013，32（2）：2427，31.

[15]BESSON F， MICHEL G. Isolation and characterization of new iturins： iturin D and iturin E[J]. J Antibiotics， 1987，40（4）：437 442.

[16]DELEU M， PAQUOT M， NY LANDER. Fengycin interaction with lipidmono layers at the air aqueous interface implications for the effect of fengycin on b iologicalm emb ranes[J]. Colloid Interface Sci， 2005，283（2）：358365.

[17]陈志谊，许志刚，陆凡，等. 拮抗细菌B916 培养液对水稻纹枯病菌的抗生活性及其抗菌物质的研究[J]. 江苏农业学报， 2000，16（3）：148152.

[18]罗楚平，陈志谊，刘永锋，等. 生防菌Bs916 合成脂肽类化合物Bac 操纵子突变株构建及功能[J]. 微生物学报， 2009，49（4）：445452.

（编辑王健）

摘要以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象，通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定，该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis，命名为HX08，并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库，获得登陆号KF774302.通过生测发现，HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究，建立了HPLC技术分离体系，使用H2O做流动相，以0.5 mL/min 流速洗脱，检测波长分别为215、254和280 nm，收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDSPAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解，利用质谱（ LTQMS） 技术进行了分子特性分析，鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.

关键词枯草芽胞杆菌；菌株鉴定；生理生化特性；杀虫活性

中图分类号S476文献标识码A文章编号10002537（2014）05001407

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）具有典型的芽胞杆菌特征，是一类好氧、内生抗逆孢子的杆状细菌[1]，作为一种有益的土壤细菌，对人畜相对安全，发达的分泌系统和抗逆生长的孢子都让其对多种病原菌产生拮抗作用[2].枯草芽胞杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，所筛得的拮抗菌株数量也较多，但是应用到杀虫方面的菌株较少，潜力有待发掘[3].鉴于目前农作物生产中存在的病虫害防治问题，本研究从本地农业生产实际出发，力求获得适合本地区的对鳞翅目害虫具有高效杀虫活性的枯草芽胞杆菌，为开发该菌的生物防治功能和扩大农作物应用范围奠定基础.

3讨论

根据该菌在平板上的菌落形态，初步推断为芽胞杆菌类，故采用高温法筛选，优化了菌株的分离过程，提高了分离效率.本研究通过一系列方法，对从湖南长沙市采集到的土样中利用高温条件筛选到的219株芽胞杆菌中，分离得到一株新菌株并进行了鉴定和归类.将测得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜寻，该株菌与Bacillus subtilis strain CU12（JX489167.1）具有很高相似性，序列相似性为99%，可认为属于枯草芽胞杆菌中一个新的菌株（HX08）.

研究发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在低pH环境下也可以诱导合成草酸脱羧酶[78]，枯草芽胞杆菌生防菌株Bs916 可产生抗菌蛋白对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum） 和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani） 的菌丝生长具有明显的抑制作用，随后鉴定该蛋白为草酸脱羧酶[910].该酶单体结构含有2个结构相似的cupin结构域， 并且在每个域的中心部位含有一个金属结合位点， 和周围的氨基酸残基结合成为双核中心， 另外它的N末端还含有短螺旋突出肽链[8]，该酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在结构域II的结合位点上[1116]，本研究分离出的活性物质的具体杀虫机理需要进一步深入研究.HX08菌株60 h的发酵液杀虫效果更为明显，说明进入生长稳定期后菌株的杀虫活性物质仍然继续增加，能提高杀虫效果.鉴于目前市场很少有能有效防治鳞翅目害虫的枯草芽胞杆菌微生物制剂[1718]，本实验分离出对棉铃虫等鳞翅目害虫有致死毒力的杀虫菌株，对研究草酸脱羧酶杀虫作用分子机制及研发新型杀虫剂提供了重要基础，为生态农业和绿色农产品产业发展提供支撑.

参考文献：

[1]刘志恒.现代微生物学[M].北京：科学出版社， 2002.

[2]李明，双宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报， 2009，40（9）：111114.

[3]程洪斌，刘晓桥，陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展[J].上海农业学报， 2006，22（1）：109112.

[4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技， 2012（3）：118119.

[5]曹茂新，洪枫，朱利民.草酸脱羧酶及其应用[J].中国生物工程杂志， 2005 ，25（Z）：170175.

[6]LIU Y， CHEN Z， NG T B， et al. Bacisubin， an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B916[J]. Peptides， 2007，28（3）：553559.

[7]刘永锋，陈志谊，周明国，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 的抑菌活性及其抑菌物质初探[J]. 农药学学报， 2007，9（1）：92954.

[8]于俊杰，陈志谊，胡建坤，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 草酸脱羧酶基因Bacisubin 的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析[J].江苏农业学报， 2012，28（3）：497502.

[9]李林珂，高玉千，崔锦，等. 一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J]. 河南农业科学， 2006（3）：5052.

[10]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 1999：370384.

[11]BANERJEE A B， BOSE S K. Aminoacid configuration of mycobacillin[J]. Nature， 1963，200：471.

[12]TAMEHIRO N ， OKAMOTO Y， OKAMOTO S， et al. Bacilysocin， a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Antimicrob agents chemother， 2002，46：315320.

[13]沈锦玉，尹文林，曹铮，等.枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质[J].水生生物学报， 2005，29（6）：689693.

[14]白延琴，辛小玲， 来有志，等.枯草芽孢杆菌的分离筛选[J].畜牧兽医杂志， 2013，32（2）：2427，31.

[15]BESSON F， MICHEL G. Isolation and characterization of new iturins： iturin D and iturin E[J]. J Antibiotics， 1987，40（4）：437 442.

[16]DELEU M， PAQUOT M， NY LANDER. Fengycin interaction with lipidmono layers at the air aqueous interface implications for the effect of fengycin on b iologicalm emb ranes[J]. Colloid Interface Sci， 2005，283（2）：358365.

[17]陈志谊，许志刚，陆凡，等. 拮抗细菌B916 培养液对水稻纹枯病菌的抗生活性及其抗菌物质的研究[J]. 江苏农业学报， 2000，16（3）：148152.

[18]罗楚平，陈志谊，刘永锋，等. 生防菌Bs916 合成脂肽类化合物Bac 操纵子突变株构建及功能[J]. 微生物学报， 2009，49（4）：445452.

（编辑王健）

摘要以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象，通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定，该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis，命名为HX08，并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库，获得登陆号KF774302.通过生测发现，HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究，建立了HPLC技术分离体系，使用H2O做流动相，以0.5 mL/min 流速洗脱，检测波长分别为215、254和280 nm，收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDSPAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解，利用质谱（ LTQMS） 技术进行了分子特性分析，鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.

关键词枯草芽胞杆菌；菌株鉴定；生理生化特性；杀虫活性

中图分类号S476文献标识码A文章编号10002537（2014）05001407

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）具有典型的芽胞杆菌特征，是一类好氧、内生抗逆孢子的杆状细菌[1]，作为一种有益的土壤细菌，对人畜相对安全，发达的分泌系统和抗逆生长的孢子都让其对多种病原菌产生拮抗作用[2].枯草芽胞杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，所筛得的拮抗菌株数量也较多，但是应用到杀虫方面的菌株较少，潜力有待发掘[3].鉴于目前农作物生产中存在的病虫害防治问题，本研究从本地农业生产实际出发，力求获得适合本地区的对鳞翅目害虫具有高效杀虫活性的枯草芽胞杆菌，为开发该菌的生物防治功能和扩大农作物应用范围奠定基础.

3讨论

根据该菌在平板上的菌落形态，初步推断为芽胞杆菌类，故采用高温法筛选，优化了菌株的分离过程，提高了分离效率.本研究通过一系列方法，对从湖南长沙市采集到的土样中利用高温条件筛选到的219株芽胞杆菌中，分离得到一株新菌株并进行了鉴定和归类.将测得的16S rRNA基因序列在NCBI 中以blast搜寻，该株菌与Bacillus subtilis strain CU12（JX489167.1）具有很高相似性，序列相似性为99%，可认为属于枯草芽胞杆菌中一个新的菌株（HX08）.

研究发现枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis在低pH环境下也可以诱导合成草酸脱羧酶[78]，枯草芽胞杆菌生防菌株Bs916 可产生抗菌蛋白对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum） 和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani） 的菌丝生长具有明显的抑制作用，随后鉴定该蛋白为草酸脱羧酶[910].该酶单体结构含有2个结构相似的cupin结构域， 并且在每个域的中心部位含有一个金属结合位点， 和周围的氨基酸残基结合成为双核中心， 另外它的N末端还含有短螺旋突出肽链[8]，该酶的Mn2+催化活性中心可能主要是在结构域II的结合位点上[1116]，本研究分离出的活性物质的具体杀虫机理需要进一步深入研究.HX08菌株60 h的发酵液杀虫效果更为明显，说明进入生长稳定期后菌株的杀虫活性物质仍然继续增加，能提高杀虫效果.鉴于目前市场很少有能有效防治鳞翅目害虫的枯草芽胞杆菌微生物制剂[1718]，本实验分离出对棉铃虫等鳞翅目害虫有致死毒力的杀虫菌株，对研究草酸脱羧酶杀虫作用分子机制及研发新型杀虫剂提供了重要基础，为生态农业和绿色农产品产业发展提供支撑.

参考文献：

[1]刘志恒.现代微生物学[M].北京：科学出版社， 2002.

[2]李明，双宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报， 2009，40（9）：111114.

[3]程洪斌，刘晓桥，陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展[J].上海农业学报， 2006，22（1）：109112.

[4]温海燕.枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].兽医科技， 2012（3）：118119.

[5]曹茂新，洪枫，朱利民.草酸脱羧酶及其应用[J].中国生物工程杂志， 2005 ，25（Z）：170175.

[6]LIU Y， CHEN Z， NG T B， et al. Bacisubin， an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B916[J]. Peptides， 2007，28（3）：553559.

[7]刘永锋，陈志谊，周明国，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 的抑菌活性及其抑菌物质初探[J]. 农药学学报， 2007，9（1）：92954.

[8]于俊杰，陈志谊，胡建坤，等. 枯草芽孢杆菌Bs916 草酸脱羧酶基因Bacisubin 的克隆、原核表达及其表达产物的酶活性分析[J].江苏农业学报， 2012，28（3）：497502.

[9]李林珂，高玉千，崔锦，等. 一株蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J]. 河南农业科学， 2006（3）：5052.

[10]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社， 1999：370384.

[11]BANERJEE A B， BOSE S K. Aminoacid configuration of mycobacillin[J]. Nature， 1963，200：471.

[12]TAMEHIRO N ， OKAMOTO Y， OKAMOTO S， et al. Bacilysocin， a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J].Antimicrob agents chemother， 2002，46：315320.

[13]沈锦玉，尹文林，曹铮，等.枯草芽孢杆菌B115抗菌蛋白的分离纯化及部分性质[J].水生生物学报， 2005，29（6）：689693.

[14]白延琴，辛小玲， 来有志，等.枯草芽孢杆菌的分离筛选[J].畜牧兽医杂志， 2013，32（2）：2427，31.

[15]BESSON F， MICHEL G. Isolation and characterization of new iturins： iturin D and iturin E[J]. J Antibiotics， 1987，40（4）：437 442.

[16]DELEU M， PAQUOT M， NY LANDER. Fengycin interaction with lipidmono layers at the air aqueous interface implications for the effect of fengycin on b iologicalm emb ranes[J]. Colloid Interface Sci， 2005，283（2）：358365.

[17]陈志谊，许志刚，陆凡，等. 拮抗细菌B916 培养液对水稻纹枯病菌的抗生活性及其抗菌物质的研究[J]. 江苏农业学报， 2000，16（3）：148152.

[18]罗楚平，陈志谊，刘永锋，等. 生防菌Bs916 合成脂肽类化合物Bac 操纵子突变株构建及功能[J]. 微生物学报， 2009，49（4）：445452.

（编辑王健）