桑树组培不定芽对卡那霉素的敏感性研究

刘淑娟，李镇刚

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

桑树是一种重要的经济作物，是中国养蚕业的饲料基础，但其组织培养研究起步较晚，笔者经过多年对桑树组培的研究与探索，已初步建立桑树高频再生体系。平野等1985年已证实桑树为易感农杆菌的植物，并且经过多年来众多科学家的研究报道证实了通过农杆菌介导的转基因操作能够在桑树中实现。

桑树的遗传转化研究起步较晚，1990年日本学者Machii通过农杆菌将β-葡萄糖苷酸酶（Gus） 基因导入桑树叶盘并在桑叶中表达获得成功。自此，国内外许多学者在桑树转基因育种这一领域做了大量的研究和探索，有了不少对桑树的转基因研究报道，而抗生素对桑树的敏感性研究则不多。卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡。因此本研究以桑树的组织培养为基础，通过在桑树丛生芽外植体继代培养基中添加不同浓度卡那霉素，以确定丛生芽发生黄化的最低浓度，为下一步桑树遗传转化阳性植株的筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试品种为广西优良杂交桑品种桂优62#的种子，置于4℃低温保存备用。

1.2 主要培养基

诱导培养基：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L+葡萄糖30 g/L+琼脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

继代培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+葡萄糖30 g/L+琼脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

生根培养基：MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

1.3 培养条件

温度为25±2℃，光照强度为1 500 lx，每天光照12 h、黑暗12 h。

1.4 试验方法

1.4.1 桑树组培外植体的获得

参照文献5的方法，于超净工作台上，取预培养萌发的种子剥离种皮，刀片切取子叶和下胚轴靠近生长点的外植体（不带胚芽），接种到诱导培养基中。在黑暗条件下培养5 d，子叶和胚轴均为乳白色，光照培养2～3 d后，转变为淡绿色，第5 d时完全变为绿色且体积明显增大，15 d左右诱导分化，可在切口处形成愈伤组织和不定芽。

1.4.2 桑树组培不定芽对卡那霉素敏感性试验

于继代培养基中添加不同浓度梯度的卡那霉素以制备筛选培养基，将上述获得的健康不定芽切取分割成独立的小芽，取大小基本相同的芽接种于筛选培养基中，每瓶接种5个芽，每个浓度梯度接种5瓶，统计芽分化率和及时观察芽的颜色形态变化。分别进行了3次不同卡那霉素浓度筛选验证，其浓度梯度如下：第1次：0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，50 mg/L，100 mg/L；第 2次：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L，125 mg/L；第3次：0 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L，70 mg/L。

2 结果与分析

2.1 桑树不定芽对卡那霉素耐受浓度的确定

待上述外植体诱导出丛生芽后，切取大小基本相似的独立的芽进行卡那霉素敏感性研究。从表1可知，卡那霉素浓度在0～150 mg/L，丛生芽的增殖系数随浓度的升高而降低，卡那霉素对丛生芽的分化具有缓慢抑制的作用。从图1可知，芽的增殖系数并没有出现急剧降低的浓度断点，卡那霉素浓度在100 mg/L下丛生芽亦能分化，说明卡那霉素可以缓慢控制丛生芽的分化率，卡那霉素浓度在150 mg/L下分化率为零，说明高浓度卡那霉素对丛生芽的分化具有完全抑制的潜力。

从图2可知，卡那霉素浓度在100 mg/L时可以基本认为丛生芽的生长完全受到抑制。如图3a，白化现象在卡那霉素浓度为50 mg/L时出现，仅叶尖出现黄色，生长和分化正常。卡那霉素浓度50 mg/L以下没有白化现象，原因可能是在低浓度下，丛生芽本身的抵抗力可以维持基本生长，随浓度的增加芽的分化率降低。

表1 不同卡那霉素浓度对丛生芽分化的影响

图1 不同卡那霉素浓度对芽增殖系数的影响

图2 不同卡那霉素浓度与芽白化率的关系

2.2 卡那霉素对丛生芽生长的影响

从表2可知，卡那霉素浓度在30～50 mg/L时丛生芽生长基本不受影响，随着卡那霉素浓度的增加其长度明显变短。卡那霉素对植物细胞的生长发育有影响，能够引起玉米、小麦、烟草、番茄等多种植物绿色器官的黄化和白化，其毒性机理主要是卡那霉素与植物细胞器叶绿体和线粒体的核糖30S亚基结合，阻止翻译过程，干扰蛋白质合成，引起试管苗同化作用受阻，生长受到抑制，长势变弱，如图3b，随着卡那霉素浓度的递增白化明显，长势变弱。

表2 不同卡那霉素浓度对丛生芽生长的影响

图3 丛生芽的生长情况

图4 不同浓度丛生芽叶子颜色的变化

如图3和图4所示，卡那霉素浓度在50 mg/L时叶片边缘出现乳黄色的现象，不过生长未受到抑制，说明此时的浓度已经对芽的叶绿体与线粒体的蛋白质合成产生了一定的干扰作用，导致其开始黄化，能正常分化说明其浓度还不足以造成芽的死亡。当卡那霉素浓度大于60 mg/L则黄化较严重，芽的分化和生长也受到抑制，由此选择卡那霉素浓度50 mg/L为桑树丛生芽遗传转化阳性苗筛选的临界浓度，则不会对桑树丛生芽的生长产生影响。

3 讨论

外源基因遗传转化受体系统需具备以下几个条件：用于遗传转化的外植体应该要具备高效稳定的再生能力；外植体来源要具有稳定性；遗传稳定性良好；对选择抗生素具敏感性，对农杆菌的浸染也要具有敏感性。经由本研究室多年的研究与探索，利用子叶和下胚轴作为外植体，通过不同浓度和种类的植物激素处理能够稳定的再生出桑树植株。平野等1985年已证实桑树为易感农杆菌的植物，并且经过多年来众多科技工作者的研究报道，证实通过农杆菌介导的基因转化操作能够在桑树中实现。本研究采用桑组培外植体丛生芽为遗传转化操作的受体，探讨了未转化丛生芽在添加卡那霉素的培养基中出现白化现象但不影响正常分化的适宜浓度。在前人的研究中，大都利用叶盘转化法获得了转基因植株，而对于木本植物的桑树而言，叶盘再生比较困难，因而制约了桑树基因转化的研究进程，因此本试验采用桑组培丛生芽作为遗传转化的载体，探讨了卡那霉素对未转化桑组培丛生芽的最低致死浓度，用于遗传转化阳性植株的筛选。理论上选用的卡那霉素浓度越高选择效果会越好，但是过高的浓度对细胞有强毒害性，此时细胞将快速死亡，死亡的或将要死亡的细胞会分泌一定的毒素对临近的细胞产生抑制作用，也不利于转化细胞的生长分化。在卡那霉素浓度50 mg/L时即出现叶尖白化现象但能正常生长、分化，卡那霉素浓度在60 mg/L及以上时桑组培外植体丛生芽的分化和芽的伸长均受到较大程度的抑制，根据试验结果，笔者选择卡那霉素浓度50 mg/L为桑组培丛生芽作为遗传转化受体阳性转化苗的筛选临界浓度。

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