实时荧光定量PCR检测幼儿腹泻腺病毒

徐志勇 龙 荣 杨 勇 朱海龙 陈 晓＊

腺病毒是一种双链DNA病毒，依据病毒株红细胞凝集能力和DNA的同源性，分为六种类型，即 A、B、C、D、E、F［1-3］。其中 F型的Ad40和Ad41是引起胃肠疾病的主要腺病毒［4，5］。目前检测腺病毒的主要方法包括病毒培养和血清学检测。病毒培养存在细胞病变效应和检测时程较长，并且有的腺病毒株不能在常用培养细胞里复制［1］等问题；血清学检测存在抗血清价格昂贵、分型技术繁琐、易出现假阴性结果等弊端。

本研究建立实时荧光定量PCR方法检测腺病毒Ad40和Ad41，并采集临床幼儿腹泻标本与血清学直接免疫荧光法进行平行检测和对比分析，为腺病毒感染检测提供新的有效方法。结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床标本收集与处理

2010-09-2013-01，武汉市儿童医院门诊幼儿腹泻标本248例，均分成两份，一份用于直接免疫荧光法检测，另一份提取病毒DNA［6］，用于实时荧光定量PCR检测。

1.2 实时荧光定量PCR

1.2.1 引物及探针：Ad40和Ad41引物及探针由上海生工生物工程有限公司合成并标记。引物设计参考序列为 AB610527.1，上游引物：5’-TGT TYG AAG TTT TCG ACG TYG T-3’，下游引物：5’-SAG GTA GAC GGC CTC GAT GA-3’，探针序列：5’-CGCATCCACCAGCCSCACC-3’。在探针5＇端标记荧光报告基团FAM（6-carboxy-fluorescein），3＇端标记荧光淬灭基团 TAMRA （6-carboxy–tetramethy-rhodamine）。

1.2.2 载体构建：用 T-A 载体克隆法［7，8］，将扩增腺病毒DNA片段克隆至pGEM-Teasy载体（中国基康生物技术公司），筛选含有插入片段的载体，用质粒DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取质粒DNA，用紫外分光光度计定量稀释成不同的浓度梯度 （拷贝数为101、102、103、104、105、106、107）作为制备标准曲线的模板。

1.2.3 PCR扩增：在50μl体系中含1×Taqman缓冲液，3.5mmol／L MgCl2，200μmol／L dATP、dCTP和 dGTP，400μmol／L dUTP，1.25UampliTaq Gold，0.5UAmp-Erase UNG，腺病毒上下游引物各0.3μmol／L，荧光探针20nmol／L，经待测样品提取的DNA或不同浓度的定量模板DNA。实时荧光定量PCR反应条件：50℃2min，95℃10min；然后95℃15s，60℃30s，共40个循环，PCR反应结束后，根据标准曲线由仪器自动分析计算出待测样品的起始拷贝数。PCR试剂盒、PCR反应管、LightCycler PCR仪均为美国罗氏公司产品。所有检测均在超净工作台中进行。每例标本平行检测三次取均值进行统计学分析。

1.3 直接免疫荧光法

待检标本涂片待干后滴加0.01mol／L pH7.4的PBS，10min后弃去，使标本保持一定湿度，再滴加荧光标记的抗体溶液（10倍稀释）（北京中生北控生物科技有限公司提供），使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温30min。取出玻片，置玻片架上，用0.01mol／L pH7.4的 PBS冲洗后，按顺序用0.01mol／L pH7.4的 PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。立即用荧光显微镜观察特异性荧光。

1.4 两种检测方法的阳性结果判断标准

实时荧光定量PCR检测腺病毒线性范围为1.0×103-1.0×107。最低检测限为1.0×103，即实际工作中样品腺病毒拷贝数＞1.0×103为腺病毒阳性。直接免疫荧光法结果判断以标本在荧光显微镜下呈绿色荧光为腺病毒阳性（图1），否则为阴性。

图1 直接免疫荧光法测定腺病毒的阳性结果（×400）

1.5 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件。两种检测方法的阳性率和方法学评价指标的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR与直接免疫荧光法腺病毒阳性检出率比较

248例幼儿腹泻标本中，直接免疫荧光法检出6例腺病毒阳性，阳性检出率为2.42%（6／248）；实时荧光定量PCR除检出直接免疫荧光法的6例阳性标本外、还检出直接免疫荧光法判断为阴性的13例标本（均已经用限制性内切酶法进行鉴定并分型确认），阳性检出率为7.66%（19／248），明显高于直接免疫荧光法（χ2＝3.675，P＜0.05）。

2.2 实时荧光定量PCR法与直接免疫荧光法检测腺病毒方法学评价指标比较

实时荧光定量PCR的灵敏度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、Kappa指数均高于直接免疫荧光法（P＜0.05），而特异度与直接免疫荧光法差别无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两种方法检测腺病毒方法学评价指标比较

3 讨 论

肠道腺病毒是一种能引起播散性腹泻的病毒，幼儿特别容易感染，病原通常是F组腺病毒Ad40或Ad41。已报道检测肠道腺病毒的方法有直接免疫荧光法、PCR和限制性核酸内切酶技术及其组合检测等［6，8］，但需要特别设备、昂贵血清及繁琐技术等的支持。因此，建立快速、简单、经济的检测腺病毒方法，不仅有利于临床观察，也有助于监测腺病毒的地区性流行情况。

实时荧光定量PCR检测肠道腺病毒的关键是设计引物和探针。基于肠道腺病毒Ad40和Ad41基因序列与其它型别腺病毒序列比对设计引物与探针，能确保实时荧光定量PCR的特异性［9］，但不能区别Ad40和Ad41病毒。直接免疫荧光法是临床实验室检测腺病毒的常用方法［8］，本文比较实时荧光定量PCR与其检测结果时发现，实时荧光定量PCR不仅能验证直接免疫荧光法检测的阳性标本，还能在直接免疫荧光法检测为阴性的242例标本中再检测出13例阳性结果，表明实时荧光定量PCR的检出率高于直接免疫荧光法。为了更进一步证实实时荧光定量PCR诊断的正确性，作者用限制性核酸内切酶法进行了鉴定并分型，结果显示19例阳性标本为Ad40和Ad41病毒（资料待发表）。

总之，本文建立的实时荧光定量PCR方法检测肠道腺病毒优于直接免疫荧光法，可为临床诊断和治疗观察提供实验室依据。

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