β—紫罗兰酮与β—乳球蛋白相互作用的光谱法研究

马保亮 魏良淑 刘桂玲 卢礼萍

摘要：在pH=7.0，t=37℃条件下，采用荧光光谱和紫外可见-吸收光谱研究了β-紫罗兰酮与β-乳球蛋白的相互作用。研究的结果表明：这种相互作用使β-乳球蛋白发生内源荧光猝灭，其机制为静态猝灭。通过计算得到了两者的结合常数（k=0.605×103L/mol）和结合位点数（n=1）。

关键词： β-紫罗兰酮;β-乳球蛋白;荧光猝灭; 同步荧光谱; 紫外可见-吸收光谱;

引言

β-紫罗兰酮（β-ionone） 是一种芳香族化合物，结构（如图2）中含有一个芳香苯环，具有疏水性。它广泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在医药工业中还可以用于合成维生素A和β-胡萝卜素[4，5]，這与人们的生活息息相关。β-紫罗兰酮是一个单体，却表现出较强的抗癌作用[6，7]。研究蛋白质与β-紫罗兰酮的相互作用，可以为了解β-紫罗兰酮的生物活性机制提供重要线索。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

F-4600型荧光分光光度计（日本日立公司）;UV-1800型紫外可见分光光度计（上海Shimadzu公司）;UB-10标准型PH计（上海华耀贸易公司 ）;FA1604B型电子分析天平（北京赛多利斯有限公司）;

β-乳球蛋白和β-紫罗兰酮购买于美国Sigma公司;磷酸钠缓冲液所用试剂为国内生化公司购置的分析纯;所用水为超纯去离子水。

1.2 实验方法

准确称量β-紫罗兰酮并配置成浓度为1mmol/L的溶液，准确称量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的缓冲液均为磷酸钠缓冲液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。

在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的缓冲溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫罗兰酮溶液，然后在27 和37 水浴锅中充分培养30分钟后开始测试荧光光谱。

荧光光谱测量，激发光狭缝和发射光狭缝均为2.5nm。內源发射荧光是以280nm作为激发光波长，记录300nm-400nm范围的发射光谱;同步荧光是固定激发波长与发射波长的间距 分别为15nm和60nm， 记录240-320nmm范围的荧光光谱。紫外可见-吸收光谱测量范围为200nm到340nm 。

2 实验结果与分析

2.1 β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白的猝灭反应

β-LG蛋白分子中含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸，具有较强的内源荧光。固定β-LG溶液浓度为0.05mg/ml，在其中加入不同浓度的β-紫罗兰酮，结果发现，β-LG的荧光峰随着β-紫罗兰酮浓度的增加而规律性降低，同时β-乳球蛋白的最大发射峰位发生5nm左右的红移，如图3所示，表明β-LG蛋白分子的构象发生了一定的改变。

对于静态猝灭，结合常数和结合位点数可由结合常数表达式（2）推导求出[10 ]：

（2）

2.4β-乳球蛋白与β-紫罗兰酮之间的能量转移效率和结合距离

根据F?rster 非辐射能量转移理论[11]，可以求出小分子与蛋白质发光基团之间的距离。

能量转移效率E与供体-受体之间距离r及能量转移距离临界R0的关系为：

（6）

R0为能量转移效率为50%时对应的距离。

（7）

其中 为取向因子，可取受能体与供能体各向随机分布的平均值 ; 为介质的折射指数，一般取水和有机物折射指数的平均值1.336， 为供能体的光量子产率，通常取蛋白质色氨酸量子产率为0.118，J为供能体的荧光发射谱与受能体的吸收光谱的重叠积分，可表示为：

（8）

其中 为供能体在波长 处的荧光强度， 为受能体在波长 处的摩尔吸光系数。摩尔能量转移效率可以由下式决定：

（9）

式中F0为能量受体不存在时能量供体的荧光发射强度， F为能量供体和受体浓度为1：1时蛋白质的荧光强度 。

图5为供能体与受能体浓度为1：1时，供能体β-乳球蛋白的荧光发射光谱（a）与受能体β-紫罗兰酮的吸收光谱（b）的光谱重叠。将图中光谱重叠部分分割成极小的矩形面积求和，应用公式（8）算得重叠积分为

代入方程（7）得到临界距离为 。由式（9）计算得到能量转移效率为 。根据公式（6）可以算出β-紫罗兰酮与β-乳球蛋白荧光残基间的距离为 。该距离小于7nm，符合能量转移理论。

2.6 β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白构象的影响

β-紫罗兰酮加入β-乳球蛋白溶液中，两者发生了结合猝灭反应的同时发射峰位红移，我们可将通过同步荧光和紫外可见-吸收光谱进一步研究β-紫罗兰酮对β-乳球蛋白构象的影响。

3 结论

以β-乳球蛋白为基体，通过荧光光谱和紫外可见-吸收光谱研究了β-紫罗兰酮与蛋白质的结合反应。β-紫罗兰酮进入蛋白质分子的疏水腔与疏水氨基酸通过氢键和范德华力发生作用，这与β-紫罗兰酮分子的疏水性有关。因为两者的结合作用，一方面，蛋白质发射荧光强度被猝灭，测算结果表明药物和发生作用的氨基酸之间作用距离较大，但仍满足非辐射能量转移的条件，这也导致了明显的荧光猝灭;另外，同步荧光光谱中色氨酸荧光发射峰位红移，体现了药物与蛋白质的结合位点靠近处于疏水区的色氨酸残基，并引起了色氨酸所在环境疏水性的变化。紫外可见-吸收光谱中190nm附近较强的吸收峰也发生了显著红移，这也进一步证明了β-紫罗兰酮的加入影响了生色团的疏水环境。

参考文献

[1]吴凤.β-乳球蛋白的分离提纯及酶源降胆固醇活性肽的研究[D].安徽农业大学，2009.

[2]李兰会，孙丰梅，黄娟，等. β-乳球蛋白的热变性聚集概述[J].中国乳品工业，2002，30（6）：22-24.

[3] Ma B L， You X ， Lu F J. Inhibitory effects of β-ionone on amyloid fibril formation of β-lactoglobulin， Int. J. Biol. Macromol. 2014，64：162-167.

[4] 孙向荣，刘家仁，孙文广等.β-紫罗兰酮诱导SGC-7901细胞凋亡作用[J].卫生研究，2007，36（6）：667-670.

[5] 孙青，舒学军，陈茹冰等.香料紫罗兰酮的合成研究[J].浙江大学学报（自然科学版），2012，39（1）：56-59.

[6] 刘家仁，李百祥，马若波等.β-紫罗兰酮对人乳腺癌细胞抑制作用[J].卫生研究，2004，33（2）：151-157.