口腔微生物生物膜分散物质的研究进展

朱彦　杨靖梅　段丁瑜　等

[摘要] 生物膜是黏附在固体表面，包裹在自身产生的胞外多聚基质中的细菌群体。生物膜的形成和发展包括细菌的黏附、繁殖和分散。附着于某表面的生物膜将其中的细菌释放、分散到周围环境以传播到新的位置形成新的群落即生物膜的分散。生物膜分散是生物膜生长发展周期中一个重要的阶段，起到重要的传播作用。对许多致病菌而言，生物膜的分散能使生物膜的细菌转化为浮游状态，促进感染的扩散。生物膜的形成能提高细菌对抗微生物剂及宿主防御反应的抵抗力。在口腔中，口腔微生物能附着于口腔组织及修复体表面形成生物膜。人类龋病、牙周病是口腔的慢性感染性疾病，它们的发生与生物膜密切相关。生物膜分散机制是近年的研究热点，促进生物膜分散的新制剂可能成为攻克生物膜感染又一靶点。分散物质的临床意义和可能的临床应用具有广阔的前景。本文对口腔中能促进生物膜分散的分散物质作一综述。

[关键词] 生物膜； 分散； 口腔微生物

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.023

口腔是一个完整而复杂的生态系统。口腔微生物群由超过600种细菌、真菌以及病毒组成[1]。这些微生物物种大部分可相互关联并形成生物膜附着于口腔软硬组织和修复体表面，是人类常见的口腔疾病如龋病、牙周病的重要始动因子[2]。

生物膜的形成和发展主要可以分为3个阶段，具体如下。1）黏附：细菌黏附定植于某表面；2）成熟：细菌繁殖、生长，并分泌胞外聚合物基质，将其包裹其中，形成成熟的生物膜；3）分散：部分细菌从生物膜上脱离，分散到周围环境中。与生物膜相关感染的治疗较为困难，其原因在于生物膜中的细菌对抗菌药物的耐药性及对人类免疫系统的抵抗性明显高于游離细菌。另一方面，当感染患者机体内游离病原菌被杀死清除以后，致病菌能再从生物膜中释放，形成游离菌，导致感染的反复发作[3]。

生物膜分散是生物膜生命周期中非常重要的一步，它使得生物膜中的微生物可以分散并传播到周围环境中形成新的微生物群落，是微生物繁殖的重要途径。对于致病菌而言，生物膜分散促进了病原菌的传播，导致感染的扩散。另一方面，胞外多聚基质的合成使得生物膜中微生物对宿主防御和抗菌药物的耐受性增加，而单个浮游状态的细菌由于脱离了生物膜这一相对有利的生存环境，对杀菌剂的敏感性大大提高，有利于细菌的清除。因此生物膜分散同时也可能成为解决生物膜感染难治性的一个有利的切入点。

尽管目前生物膜分散的机制尚未完全明了，但是近年来随着对生物膜分散研究的逐步深入，影响生物膜分散的因素越来越多地被研究者发现。本文主要就口腔微生物生物膜分散物质的研究进行综述。

1 分散蛋白B（dispersin B）

伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetem-comitans，A. actinomycetemcomitans）为定植于人类口腔中的一种革兰阴性的兼性厌氧杆菌，是侵袭性牙周炎的主要可疑致病菌[4]。它能形成牢固附着的菌斑生物膜，能抵抗蛋白酶、超声、洗涤剂等清除作用。体外实验证实，以生物膜为存在形式的伴放线放线杆菌相较于其游离状态时对李斯德林、氯己定、Plax漱口水的杀菌作用的抵抗力大大提高[5]。这也是常规的牙周治疗不能轻易地根除伴放线放线杆菌造成感染的原因之一。

分散蛋白B是由伴放线放线杆菌分泌的一种多糖水解酶，它是目前研究得较多的一种降解生物膜基质的酶，能降解聚-N-乙酰氨基葡聚糖（poly-N-acetylglucosamine，PGA）。PGA能调节伴放线放线杆菌在物体表面的附着及细胞间的集聚，是生物膜基质的重要组成成分，能帮助细菌抵抗抗菌药物以及吞噬细胞的作用。Kaplan等[6]通过对比伴放线放线杆菌临床野生菌株及不能分泌分散蛋白B的变异菌株发现，不能分泌分散蛋白B的变异菌株尽管在形态学上与野生菌株大致相同，但变异菌株不能释放细胞到培养基中。Itoh等[7]将纯化的分散蛋白B加入以上变异株的培养基，能够使变异株形成的生物膜恢复释放细菌的能力；在其他能产生PGA的细菌所形成的生物膜中加入纯化的分散蛋白B也能导致细菌从生物膜中释放，进一步证实了分散蛋白B在生物膜分散中的作用。通过对伴放线放线杆菌野生菌株以及变异菌株所形成的菌斑生物膜对比观察发现，野生菌株生物膜在成熟过程中其内部逐渐形成空腔，空腔内缺乏生物膜基质多糖，有一层不集聚的浮游细菌沿壁环绕，空腔在接近生物膜表层时破溃，释放其中的游离细菌到周围的环境中。而变异菌株生物膜内虽然也有空腔存在，但却缺乏环绕的浮游细菌层，并且不再释放细菌、发生分散[8]。

伴放线放线杆菌所形成的生物膜被自身合成的胞外基质包裹，基质包含有Ⅳ型菌毛、胞外DNA及胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），PGA是胞外多糖的主要成分。在成熟的生物膜中，EPS可占生物膜总体积数的90%以上，分散蛋白B作为β-己糖苷酶对EPS中的PGA进行水解，从而导致了缺乏生物膜基质多糖的空腔形成，进一步发生生物膜的分散。

分散蛋白B的另一个作用底物可能是基质中的Ⅳ型菌毛，该菌毛与伴放线放线杆菌的黏附能力密切相关[9]。Ⅳ型菌毛的主要亚单位为菌毛相关蛋白（fibril-associated protein，Fap）-1，Fap-1蛋白存在翻译后修饰，可能主要为糖基化作用，这一过程可能有PGA参与，分散蛋白B可通过裂解Fap-1蛋白中的PGA降低细菌之间的黏附作用，从而达到细菌分散的目的。

2 表面蛋白释放酶（surface-protein-releasing en-

zyme，SPRE）

变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是人类主要的致龋菌，其在口腔中的定植与龋病的发生密切相关。表面蛋白P1（也称为抗原Ⅰ/Ⅱ、PAc）存在于S. mutans细胞表面，可与唾液糖蛋白结合，导致细菌集聚；也可与黏附于牙面上的唾液蛋白结合，从而介导S. mutans与牙面的黏附。S. mutans可分泌一种内源性SPRE，能使表面蛋白P1从细胞表面释放、脱离出来，从而调控S. mutans生物膜的分散[10]。

Lee等[10]运用改良后的恒化器培养S. mutans，使其在羟磷灰石柱上形成单层的S. mutans生物膜，并通过活细胞计数判断生物膜中细胞的分散情况，实验发现S. mutans生物膜的分散活动随着pH的降低而增快，在pH值为5～6时达到最大速度。通过外源性添加SPRE后观察，恰巧在这个pH范围内，SPRE作用下表面蛋白的释放速度达到最高峰。进一步研究表明，当pH为6，细胞的分散与温度有密切关系，在温度为3 ℃时生物膜的分散率达到最高。这些结果表明S. mutans的分散也许是一个主动的酶作用的过程。

细菌菌细胞分裂增殖也可引起一定程度上的生物膜分散，当位于生物膜最外层表面的菌细胞分裂时，由于其受到的吸引力和黏附力较小，分裂的细胞可能会脱离生物膜的表面分散到周围环境中去。Vats等[11]通过运用休眠期的细胞在不给予外力的条件下培养出单层的S. mutans生物膜进行实验，来排除切应力或细胞分裂的因素对细胞分散的影响。实验证实S. mutans生物膜的分散与温度相关，并且外源性加入SPRE能促进其分散，而通过链霉蛋白酶或热处理后的SPRE则失去这一作用。

除了S. mutans以外，在其他一些非口腔细菌中也发现了许多与生物膜分散有关的蛋白酶，如恶臭假单胞菌分泌的LapG蛋白酶作用于细胞表面的LapA蛋白从而调节生物膜的分散[12]；金黄色葡萄球菌分泌的金属蛋白酶和Spl丝氨酸蛋白酶也与生物膜的分散有关[13]。由此可见，蛋白酶与生物膜分散之间有着密切的关系。目前为止S. mutans所分泌的SPRE作用于表面蛋白P1的确切位点以及SPRE的生化性能并未完全明了，但是其对生物膜分散的作用对于治疗口腔中由S. mutans所致的龋病的防治有着重要的研究意义，SPRE有着广阔的研究空间。

3 透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）

HAase是由中间链球菌（Streptococcus interme-dius，S. intermedius）所分泌的可降解葡萄糖胺聚糖透明质酸的酶。S. intermedius存在于人类口腔、胃肠道及泌尿系统中，在口腔中主要定植于牙面上的牙菌斑生物膜中，与牙周疾病及种植体周围炎的发生有密切关系[14-15]。透明质酸（hyaluronan，HA）是一高分子质量多糖，由N-乙酰氨基葡聚糖与葡萄醛酸残基通过糖苷键结合构成，是结缔组织重要的胞外基质[16]。在口腔中，HA可在唾液、口腔黏膜上皮及龈沟液中检测到，唾液和结缔组织中的HA可能作为营养物质以及细菌附着的基底物质，也可能是生物膜细胞外多聚基质的重要组成成分。位于龈沟部位的HAase能通过降解HA，从而破坏牙周组织的完整性，造成牙周组织的破坏以及毒素的扩散。患有龈炎的年轻成年男性，其病情的严重程度与他们唾液中HAase的活性成正相关关系。在口腔链球菌中，仅有S. intermedius和星座链球菌能产生HAase。

Pecharki等[17]通过研究HAase在S. intermedius生物膜形成与分散过程中的作用发现，在补充了HA的培养基上，HAase失活株形成的生物膜增加了31%，而加入外源性HAase可导致S. intermedius生物膜的分散。认为HAase可能破坏S. intermedius细胞表面配基和生物膜的胞外基质，而促进生物膜的分散。为了证实这一观点，将HAase添加到在补充了HA的培养基中形成的S. intermedius生物膜中，18 h后通过扫描电镜发现生物膜的总量大量减少，结果表明，HA是S. intermedius生物膜胞外结构的重要组成成分。

HAase通过降解HA促进S. intermedius生物膜分散。类似于这种通过降解生物膜附着的基底而促进生物膜分散的分散机制也存在于许多非口腔致病菌中，如肠道病原菌霍乱弧菌合成一种血凝素蛋白酶（hemagglutinin protease，HAP），通过降解肠道上皮细胞表面与霍乱弧菌相连接的受体，从而促进生物膜从肠道上皮脱离、分散[18]。海洋细菌交替假单胞菌和弗尼斯弧菌在动物甲壳表面形成生物膜，分泌甲壳素酶降解甲壳素（又称几丁质、壳多糖）获得营养，并使生物膜得以分散[19-20]。

4 脂肪酸（fatty acid）

脂肪酸作为生物膜分散信号分子最早是由Dow等[21]在野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris，X. campestris）中发现的，其化学结构为顺-11-甲基-

2-十二碳烯酸，由RpfF基因编码。脂肪酸通过上调甘露聚糖内切酶降解生物膜基质引起X. campestris生物膜分散。Davies等[22]发现铜绿假单胞菌（Pseudo-monas aeruginosa，P. aeruginosa）在生长过程中可分泌一种短链不饱和脂肪酸顺-2-癸烯酸，当向P. ae-ruginosa生物膜中外源性加入浓度为2.5 nmol·L-1的顺-2-癸烯酸时，能引起生物膜的分散。

白色假丝酵母菌（Saccharomyces albicans）是正常人口腔、胃肠道、呼吸道及阴道黏膜的常见共生菌，在特定条件下造成宿主的感染，为条件性致病菌。白色假丝酵母菌是公认的口腔白斑发生与癌变的相关因子，若白斑上皮异常增生病变中发生白色假丝酵母菌感染，癌变的可能将大为增加。Davies等[22]在实验中发现，当外源性添加1.0～10 mmol·L-1的顺-2-癸烯酸，可诱导白色假丝酵母菌生物膜发生分散。在口腔内，研究[23]发现，S. mutans也能分泌一种类似于脂肪酸的反式-2-癸烯酸，其对白色假丝酵母菌芽管的生长有抑制作用。顺-2-癸烯酸也能诱导大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、奇異变形杆菌（proteus mirabilis）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）所形成的生物膜的分散。这些结果表明脂肪酸可能不仅是细菌与细菌之间，甚至可能是细菌与真菌之间的信号分子。

脂肪酸引起生物膜的分散可能是多种因素共同的影响。如脂肪酸对X. campestris生物膜的分散作用是通过上调甘露聚糖内切酶，降解生物膜基质而促进其分散。在对嗜麦芽黄杆菌研究的实验中发现，添加脂肪酸能增强细菌的活动性。另外有研究者[24]将白色假丝酵母菌分别在没有添加多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）及添加了浓度为1 mmol·L-1 PUFAs的培养基中培养观察，发现后者细胞内线粒体膜减少，胞核浓染，说明在添加了PUFAs的培养基中的白色假丝酵母菌发生了凋亡。在对生物膜分散机制的研究发现，细胞的凋亡以及细菌的能动性都可能是导致生物膜分散的因素，因此脂肪酸对生物膜的分散作用可能是由多方面的共同作用引起的。

5 自诱导物-2（autoinducer-2，AI-2）

细菌能够自发产生一些化学信号分子释放到周围环境中，感应这些信号分子的浓度可使细菌获知周围细菌的密度，通过感知菌群密度的变化从而调控特定基因的表达，调节细菌群体的一些行为，如生物发光、毒力基因的表达、生物膜形成等，这种调控机制称为细菌的群体感应（quorum sensing，QS）[25]。

AI-2是细菌的非特异性群体感应信号分子，其产生依赖LuxS蛋白，结构为呋喃硼酸二酯，在革兰阳性和革兰阴性菌中广泛存在，被看作是细菌种间的QS信号分子[26-27]。霍乱弧菌缺乏AI-2的变异株能形成更厚的生物膜，且分散速率降低[28]。表皮葡萄球菌luxS基因变异株较野生株生物膜形成量增加，且胞外多糖合成也明显增多[29]。

口腔中，AI-2已在格氏链球菌（Streptococcus gordonii，S. gordonii）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyro-monas gingivalis，P. gingivalis）、S. mutans及伴放线放线杆菌中被检测到。在对口腔细菌的luxS系统的研究中发现，S. mutans及伴放线放线杆菌的luxS缺陷株所形成的生物膜量均变少；在外观上，S. mutans的luxS缺陷株形成的生物膜粗糙、稀薄，而野生株生物膜均匀、平滑且连续，并且luxS缺陷株对去垢剂和抗生素的抵抗力明显高于野生株[30-32]。加入AI-2抑制剂卤代呋喃酮可抑制口腔中S. mutans、S. inter-medius、咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）的生物膜生长[33]；S. gordonii与P. gingivalis的luxS缺陷株两者无法像野生株那样形成共生生物膜，而当导入带有luxS基因的质粒后，两者恢复形成共生生物膜的能力[34]。

Roy等[35]运用AI-2类似物研究AI-2在大肠埃希菌以及P. aeruginosa生物膜形成与分散中的影响发现，在生物膜生长过程中持续加入AI-2类似物会抑制生物膜的发展。与未经AI-2类似物处理的对照组相比，对照组形成的生物膜更厚且更有序。另外通过将AI-2与接近最低抑菌浓度的庆大霉素联合运用于已经形成的生物膜，能观察到接近全部的生物膜被清除。

由此可见，luxS/AI-2系统对不同细菌的生物膜的形成及分散可起到不同的调控作用，并且能介导共生生物膜中细菌间的相互作用。

6 展望

细菌在环境中有两种存在形式，一种是以浮游状态存在，为单个或少量聚集的细菌团块；一种以生物膜的状态存在，由细菌附着于有生命或无生命物体的表面形成，并被自身分泌的胞外多聚基质包裹。以生物膜为存在形式的微生物对抗菌药物及人体自身免疫系统抵抗力大大提高，细菌释放毒性刺激机体产生大量特异性抗体及细胞因子，这些免疫成分被生物膜胞外基质阻挡，不能渗入生物膜内而在感染局部形成免疫复合物，损伤人体自身组织，加重炎症破坏。一方面，生物膜的分散可以使细菌从生物膜中释放，在新的位置形成新的菌落，使感染在宿主体内、宿主之间扩散。另一方面，分散的细菌脱离了生物膜这一保护环境后，对抗菌药物以及人体免疫系统的抵抗力降低，有利于抗菌药物和人体吞噬细胞对它们的清除。

近年来关于生物膜分散的研究越来越多，人们期望通过认识生物膜分散的机制、影响生物膜分散的因素，寻求解决生物膜感染这一难题的新思路。浮游菌较生物膜内细菌对抗菌药物的敏感性高，生物膜分散可能会使抗菌药更有效地发挥作用。一些生物膜分散剂，如基质降解酶、群体感应信号分子、表面活性剂以及鸟苷酸环化酶抑制剂都有可能成为抗生物膜感染的重要武器。Darouiche等[36]将分散蛋白B与三氯生联合运用于中心静脉导管感染，起到了强大的抗菌和抗微生物膜的效用。Izano等[37]测试使用0.01%阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）对伴放线放线杆菌生物膜的杀菌作用，通过对比伴放线放线杆菌在3组分别经过磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）；分散蛋白B预处理5或30 min，然后再使用SDS处理5 min，计算试管中的菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）数，结果发现，经过分散蛋白B预处理后，SDS可使CFU数量明显下降。因此，尽管生物膜的分散一方面会促进细菌的分散和传播；另一方面，在临床上可以运用生物膜分散物质与抗菌药物的联合应用，控制细菌生物膜感染。生物膜分散物质具有巨大的临床应用前景。

龋病和牙周病是人类最常見的两类口腔疾病，它们的发生都与牙菌斑生物膜密切相关。通过生物膜的分散，减少细菌在口腔软硬组织或修复体表面的附着，降低细菌对抗菌药物的耐受性，增强口腔内生物膜的清除能力，可能成为龋病与牙周病治疗的新方法。目前对生物膜分散的研究大多还处于体外实验阶段，并且多是对单一细菌生物膜的研究，相信随着研究的深入，必将给由生物膜感染造成的口腔或人体其他部位疾病的治疗带来更多新的思路和方法。

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（本文編辑 杜冰）