防治花鳗鲡细菌性疾病的中西药筛选

佟延南 王德强 李芳远 李忠琴

摘要 [目的] 为花鳗鲡的病害防治提供科学、有效的理论依据。[方法] 从花鳗鲡内脏组织中分离出3株病原菌（迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、威隆气单胞菌），选择4种中药（虎杖、大黄、五倍子、黄连）和3种西药（氟苯尼考、阿莫西林、强力霉素）采用琼脂平板稀释法进行体外抑菌试验。[结果] 4种中药和3种西药对花鳗鲡致病菌均有不同程度的抑菌、杀菌效果。五倍子、大黄和氟苯尼考的抑菌能力最强，可作为防治该病的有效药物。[结论] 建议在生产实践中多使用中草药或中西药联用。

关键词 花鳗鲡；病原菌；防治；抑菌试验

中图分类号 S965.223 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10971-02

Screening Chinese Herbal Medicine and Western Medicine for Controlling Bacterial Diseases of Anguilla marmorata

TONG Yannan， WANG Deqiang*， LI Fangyuan et al

（Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences， Haikou，Hainan 570100）

Abstract [Objective] The research aimed to provide scientific and effective theoretical basis for controlling the diseases of Anguilla marmorata. [Method] Three strains of pathogenic bacteria （including Edwardsiella tarda， Aeromonas hydrophila and Aeromonas veronii）were isolated from the internal tissues of Anguilla marmorata. Four kinds of Chinese herbal medicine （Fallopia japonica， Rheum officinale， Rhus chinensis and Coptis chinensis） and three kinds of western medicine （florfenicol， amoxicillin and doxycycline） were selected to make the antibacterial test in vitro by using agar plate dilution method. [Result] Four kinds of Chinese herbal medicine and three kinds of western medicine had antibacterial effects on pathogenic bacteria of A. marmorata. Rhus chinensis Mill.，Rheum palmatum Linn.and florfenicol had the highest antibacterial effects， so they could be used as the effective drugs against these diseases. [Conclusion] It was suggested that more Chinese herbal medicine and combined application of Chinese herbal medicine and western medicine should used in the production.

Key words Anguilla marmorata； Pathogenic bacteria； Prevention and control；Antibacterial test

花鳗鲡（Anguilla marmorata）为脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鳗鲡总目、鳗鲡目、鳗鲡科、鳗鲡属的一种，又称鲈鳗，是世界上鳗鲡属中分布最广泛的一种^[1]，北至韩国济州岛、东至小笠原群岛、南至南太平洋的马克萨斯群岛、西至非洲东海岸的纳塔尔均有分布；在我国自钱塘江至海南省各江河水系中都有分布。

花鳗鲡因其市场价格是其他鳗鲡品种的3～5倍，备受养殖者的青睐，盲目的集约化养殖和养殖環境的不断恶化，导致近几年花鳗鲡养殖病害频繁发生，经济损失惨重。以往关于花鳗鲡的研究集中在其分类、地理分布、生活习性、资源调查等方面^[2-6]，而在花鳗鲡病害防治药物的研究上极少。笔者以自主分离的花鳗鲡致病菌为研究基础，选择4种中药和3种西药采用琼脂平板稀释法，针对分离的3株花鳗鲡致病菌进行体外抑菌试验，以期为养殖户提供科学、有效的病害防治理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

患病鳗鲡采至海南省海口市大致坡花鳗鲡养殖场，从其内脏（肝脏、肾脏、脾脏等）器官分离、纯化到3株病原菌，由厦门市集美大学水产学院协助，通过生理生化和基因鉴定，3株病原菌分别确定为迟钝爱德华氏菌（Sh1）、嗜水气单胞菌（L2b）、威隆气单胞菌（L2s）。

1.2 试验药材

中药：虎杖（Rhizoma polygoni Cuspidati，简称 RPC）；大黄（Rheum palmatum Linn.，简称RPL）； 五倍子（Rhus chinensis Mill.，简称RCM）；黄连（Coptis chinensis Franch，简称 CCF）。

西药：氟苯尼考（Florfenicol）、 阿莫西林（Amoxicillin）、强力霉素（Doxycycline hyclate tablets）。

1.3 中药加工

首先，用中药粉碎机粉碎至 100 目左右，然后放入超微粉碎机进一步粉碎，收集超微药粉备用。在扫描电子显微镜下观察，90%以上的颗粒粒径大小为 5～10 μm。

1.4 菌悬液的制备

将保种的菌液接种于琼脂平板上，置于28 ℃恒温培养箱内培养 20～24 h；挑取单个菌落划线至新鲜斜面上，28 ℃下培养20～24 h 后，用无菌生理盐水将菌体冲洗下来，使用浊度仪将菌液浓度稀释至 107 CFU/ml，即可作为药敏试验接种的菌悬液。

1.5 中草药抑菌试验

采用琼脂稀释法^[7]，以中草药为溶质，以营养琼脂培养基为溶剂，配制出2倍浓度梯度的药敏培养基（除五倍子的稀释梯度为0.50、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625和0.007 812 5 mg/L；其他3种中草药的稀释梯度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/L）。药敏培养基均经过高压灭菌后倒平板，取已调好浓度的菌液2 μl接种在含药平板上，每个药物梯度做3组平行试验。将接种好的平板放置28 ℃培养箱培养24和48 h。

1.6 西药抑菌试验

首先用无菌水配置1 mg/ml西药母液，然后以高压灭菌后的营养琼脂培养基为溶剂，采用二倍稀释法配制不同浓度梯度的药敏培养基（浓度梯度为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1和0.05 μg/L）。取已配制的菌液2 μl接种在含药平板上，每个药物梯度做3组平行试验。将接种好的平板放置28 ℃培养箱培养24和48 h。

1.7 结果观察

以 24 h 无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低抑菌浓度（MIC），以 48 h药板上无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低杀菌浓度（MBC）。只有2个平行组的MIC值或MBC值一致时，才能界定为抑菌（杀菌）浓度，否则需要进行重复试验。

2 结果与分析

2.1 中草药对3株病原菌的抑制作用

比较了 4 种中药对养殖花鳗鲡 3株病原菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。由表1可知，五倍子、大黄、黄连、虎杖对 3株致病菌均具有一定的抑制效果，且MIC值和MBC值相等或呈双倍关系。其中，4种中草药对Sh1菌株的MIC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖；4种中草药对Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖，五倍子和黄连的MIC值和MBC值相同，大黄和虎杖的MBC值是MIC值的2倍。4种中草药对L2b菌株的MIC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖；4种中草药对Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖，五倍子、黄连和虎杖的MIC值和MBC值相同，大黄的MBC值是MIC值的2倍。4种中草药对L2s菌株的MIC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖；4种中草药对Sh1菌株的MBC值：五倍子<大黄<黄连<虎杖，五倍子、大黄和黄连的MIC值和MBC值相同，而虎杖的MBC值是MIC值的2倍。

2.2 西药对3株病原菌的抑制作用

比较了3种西药对养殖花鳗鲡 3株病原菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。由表2可知，氟苯尼考、阿莫西林和强力霉素对3株致病菌均有良好的抗菌活性，其中强力霉素对Sh1菌株的MIC值最小，达到0.2 μg/ml；其次是氟苯尼考、阿莫西林，对Sh1菌株的MIC值分别达到0.8和6.4 μg/ml；阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值为25.6 μg/ml。氟苯尼考对L2b菌株的MIC值最小，小于0.05 μg/ml；其次是强力霉素、阿莫西林，对L2b菌株的MIC值分别为0.2和6.4 μg/ml；阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值与MIC值均小于0.05 μg/ml。氟苯尼考对L2s菌株的MIC值最小，小于0.05 μg/ml，其次是强力霉素、阿莫西林，对L2b菌株的MIC值分别为0.8和3.2 μg/ml；阿莫西林和强力霉素的MBC值与MIC值相同，氟苯尼考的MBC值与MIC值均小于0.05 μg/ml。

3 讨论与结论

3.1 中药对3株花鳗鲡病原菌的抑制作用

中草药具有天然性、营养性、毒副作用小、无抗药性等优点^[8-9]，其在水产养殖中的主要作用包括：防治疾病、增强免疫力；促进生长，提高饲料利用率；提高存活率；减少应激作用，增加动物的耐受力等作用^[10-12]。笔者研究了4种中草药对3株花鳗鲡致病菌的MIC值和MBC值，其平均MIC值大小依次为虎杖>黄连>大黄>五倍子，平均MBC值大小依次为虎杖>黄连>大黄>五倍子。不同中草药对同一菌株的抑制效果不同，其原因可能是不同中药草其抑菌成分不同，如五倍子的主要抑菌成分为丙酮提取物^[13]；而黄连的主要抑菌成分为小檗碱^[14]。另外，各试验组中有些菌株的MIC值和MBC值略有不同，说明中草药作用于该菌株时，其抑菌浓度和杀菌浓度不同，为今后生产与应用提供理论依据。

3.2 西药对3株花鳗鲡病原菌的抑制作用

临床实践表明，抗菌西药对各种细菌性疾病均有良好的疗效。该研究中3种抗菌西药对3株花鳗鲡病原菌均具有较好的杀菌、抑菌效果，其平均MIC值大小依次为阿莫西林>强力霉素>氟苯尼考，平均MBC值大小依次为阿莫西林>强力霉素>氟苯尼考。但是，同种抗菌药对不同菌株抑菌效果有所差異，氟苯尼考对Sh1抑制效果最差（MIC值为0.8 μg/ml），强力霉素对L2s抑制效果最差（MIC值为0.8 μg/ml），而阿莫西林则对Sh1和L2b抑制效果最差（MIC值为6.4 μg/ml）。

该研究中4种中草药和3种西药对花鳗鲡致病菌均有不同程度的抑菌、杀菌效果，但因抗生素经常导致耐药菌株的产生和水产品药物残留等问题^[15]，建议在生产实践中多使用中草药或中西药联用，而中西药联用配伍比例有待下一步研究。

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