“勿忘我”丛生芽诱导及植株再生

王淑敏 高永闯 李晓云

摘要 [目的] 研究“勿忘我”丛生芽诱导及植株再生。 [方法]以勿忘我为试材，取其茎尖、叶片和下胚轴为外植体，进行丛生芽诱导试验。[结果]用茎尖作外植体产生丛生芽数量最多；以MS + 6BA 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L诱导成苗率最高，芽苗健壮；生根阶段以1/2MS+IBA0.2mg/L生根效果最好，生根率可达100%。[结论] 研究勿忘我丛生芽诱导及植株再生具有一定的实践意义和应用价值。

关键词 勿忘我； 丛生芽； 再生植株

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10842-03

Study on Cluster Bud Induction and Plant Regeneration of Myosotis sylvatica

WANG Shumin ，GAO Yongchuang，LI Xiaoyun

（College of Life Science， Langfang Teachers University， Langfang， Hebei 065000 ）

Abstract [Objective] The aim was to study cluster bud induction and plant regeneration of Myosotis sylvatica.[Method]Using Myosotis sylvatica as test materials， cluster bud induction was carried out taking its stem tip， leaf and hypocotyl as explant . [Result] Cluster bud induction number was the largest using stem tip as explant. MS + 6BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L induction rate was highest，and bud seedling was strong； 1/2 ms + IBA0.2 mg/L rooting effect was best in rooting stage， and rooting rate could reach 100%. [Conclusion] Studying cluster bud induction and plant regeneration of Myosotis sylvatica had certain practical.

Key words Myosotis sylvatica； Cluster bud； Plant regeneration

勿忘我（Limonium sinuatum（L）.Mill）属蓝雪科（Plumbaginaceae）补血草属（Limonium）多年生或二年生草本植物，原产地中海沿岸地区，株高可达1.1 m，花色繁多，具有天然干花的特性，花瓣含水量低，富有蜡质，在植株体上呈现出干燥的蜡质或纸质的特色，可以长期保持美丽的花色和花型，是目前天然干花类中作切花批量生产的花之一^[1]，也可在野生园林中作露地栽培，或剪下作小插花中主花的配花^[2]。药理研究表明，勿忘我花茶含有丰富的维生素C，可延缓细胞衰老，提高机体免疫能力，抗病毒，抗癌防癌并能美白肌肤，具有护肤养颜、补肾提神、健胃开胃、调节血脂减肥、促进新陈代谢等功能^[3]。

补血草属植物具有大量的不孕枝和同型杂交不孕的特性，种子结实少，若用种子繁殖，种子来源的可靠性限制了批量生产^[2]。因此研究勿忘我丛生芽诱导及植株再生具有一定的实践意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

1.1.1 试验材料。

选取饱满无虫害的勿忘我种子。

1.1.2 消毒方法。

将勿忘我种子，用无菌水冲洗3次，再用75%乙醇消毒30～40 s，无菌水冲洗5次，分别用0.1%升汞、2%次氯酸钠消毒处理，具体为：

①0.1%升汞5 min；②0.1%升汞7 min；③0.1%升汞9 min；④2%次氯酸钠8 min；⑤2%次氯酸钠13 min；⑥2%次氯酸钠18 min。

每次处理完用无菌水冲洗8～10次，每次1 min。然后将无菌种子种植在放有滤纸的无菌瓶和MS固体培养基中，置恒温培养室中23 ℃培养，待发育成无菌苗。15 d后统計发芽率、污染率。

发芽率=（发芽种子数/接种种子数）×100%

污染率=（污染种子数/接种种子数）×100%

1.2 培养基

1.2.1 丛生芽诱导培养基。

A1：MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；

A2：MS+6BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；

A3：MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

1.2.2 生根培养基。

B0：1/2 MS；

B1：1/2 MS + IBA 0.2 mg/L；

B2：1/2 MS + IBA 0.4 mg/L；

B3：1/2 MS + IBA 0.6 mg/L。

1.3 丛生芽诱导

分别取勿忘我的下胚轴（长0.5 cm）、茎尖（长1 cm）、子叶（0.5 cm×0.5 cm）作为外植体，3种外植体均接种到A1 、A2、A3培养基上，在各培养基上接种30个，接种后在24 ℃下培养进行丛生芽诱导^[4-6]。

1.4 生根与植株再生

剪取健壮的单芽（长1.5～2.0 cm），分别接种到B0 、B1、 B2、B3培养基上进行生根。

2 结果与分析

2.1 种子消毒结果

不同材料所用消毒液不同，消毒效果也不同。对于勿忘我种子而言，消毒效果最好的是升汞，但处理时间过长易把种子杀死。首先取空白对照组，不加处理的勿忘我种子的发芽率为69%，污染率为71%。由表1可知，0.1%的升汞和2%的次氯酸钠对勿忘我种子的消毒效果都很好，没有污染，并在特定的消毒时间段内，对种子的活性影响也较小。由此可知，使用次氯酸钠对忽忘我种子消毒更适宜，尤以消毒8 min为宜，处理后对种子萌发率影响不大。勿忘我种子在接种15 d后即可长成绿色健壮的无菌苗。

2.2 不同外植体对不定芽形成的影响

以茎尖为外植体，在基部膨大形成球状愈伤组织，随后产生大量丛生芽，速度最快的接种20 d后即有芽点形成；以茎段为外植体，茎段整体膨大，未产生丛生芽；以子叶为外植体，未形成芽。不同外植体对不定芽诱导效果影响很大，出芽情况以茎尖出芽率最高，而茎段和子叶则不能诱导出丛生芽。

2.3 不同浓度的6BA对茎尖丛生芽诱导的影响

接种后茎尖在下端边缘开始膨大增厚，继而周围出现浅绿色颗粒状突起，约25 d后，这些突起继续生长成淡绿色小芽。由表2可知，茎尖丛生芽发生数量随6BA浓度的升高而增多。从生长状态来看，A3培养基所诱导的芽虽然在所有培养基中的芽数最多，但其芽的质量较其他培养基而言不高（图2），表明虽然6BA打破了其顶端优势，但其各个丛生芽的生长点不突出，芽的健壮程度也较低。综合来看，A2培养基上的芽生长最好，出芽率适中，芽也健壮（图1）。故在茎尖丛生芽的诱导中，6BA的浓度以1.0 mg/L为宜。

2.4 不同浓度的6BA对子叶丛生芽诱导的影响

子叶作为外植体接种到培养基上后无变化，随着时间的推移子叶出现不同程度的褐化。在A1、A2和A3培养基中，子叶均没有诱导出丛生芽，最后褐化干枯死亡。

2.5 不同浓度的6BA对茎段丛生芽诱导的影响

茎段作为外植体在丛生芽诱导过程中，膨大，但没有产生愈伤组织，随着时间的推移膨大的茎段褐化而死，最终没有丛生芽的诱导；这可能是因为产生了大量次级代谢物，这些次级代谢物最后导致茎段死亡，没有诱导出丛生芽。茎段丛生芽的诱导率也为0。

2.6 诱导芽苗生根效果

生根诱导以1/2MS为基本培养基，附加IBA，设计4个浓度水平。将继代培养后高度达1.5～2.0 cm，生长健壮的芽苗进行生根诱导。无根苗在生根培养基中，约9 d后分化形成根。

3 讨论

3.1 外植体消毒

从外界取得的外植体进行接种时，常含有较多的杂菌，对其消毒时间太短不易除去，时间太长又会对外植体造成较大的伤害。该试验选取种子进行消毒较容易，基本解决了上述问题，污染率降低，适合选用。在试验中采用2种方式进行消毒，最终结果都很好，没有出现污染，而且在种子萌发率上差别也不大。综合简单易行的原则和环境友好性原则，推荐使用次氯酸钠作为消毒剂，处理时间以8 min为宜。

3.2 外植体选择

该试验选取茎尖、茎段（不带腋芽）、子叶作外植体，通过诱导，3种外植体都可诱导出愈伤。但茎段和子叶不能诱导出丛生芽，茎段膨大出现愈伤后再培养则会褐化死亡。茎尖作为外植体诱导速度最快，芽苗健壮，增殖率高，是勿忘我进行离体快速繁殖的最佳外植体。

3.3 最佳丛生芽诱导培养基

冯晓英在对6苄氨基嘌呤（6BA）、激动素（KT）和苯基噻二唑脲（TDZ）在勿忘我芽增殖上的效果进行了比较。苯基噻二唑脲（TDZ）是一种具有高度细胞分裂素活性的棉花脱叶剂，当TDZ浓度为0.01 mg/L时，勿忘我离体培养芽增殖的能力相当于6BA 0.4 mg/L时的增殖能力。当TDZ浓度为0.04和0.06 mg/L时，芽的增殖效果与不加任何试剂差异不大。

3.4 最佳生根培养基

观察发现，NAA诱导生根，根基部愈伤组织较少，根粗壮，数量多，且有一定的长度；IBA则根少细长。结果表明，试管苗生根以0.4 mg/L NAA效果较好，其次是0.6 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA。在植物试管苗微型繁殖诱导生根阶段，由于培养环境的高温、高湿和弱光等因素的影响，常使得芽苗徒長和根系纤弱，导致再生小植株的抗逆性差和移栽成活率低。这表明，低浓度的PP333对根的生长有促进作用，生根率与对照组只加 0.4 mg/L NAA 差异不大，但可以使根加粗，而高浓度时所需根长时间明显缩短，生根率降低，根特粗。从苗长势来看，以在生根培养基中附加0.02%PP333的长势为好。

参考文献

[1] 金波.鲜切花栽培技术手册 [M].北京：中国农业大学出版社，1998：50-65.

[2] 周昆华，易栽培.久不凋的花卉勿忘我[J].云南农业科技，1993（6）：36.

[3] 高丽霞，邢柏芝.补血草组织培养试验[J].北方园艺，1999（2）：5.

[4] 陈佳瀛，杜秀达.补血草的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2002，12（6）：594.

[5] 王秀丽，杨煜，徐平丽，等.植物组织培养的应用及进展[J].山东农业科学，2005（3）：78-80.

[6] 王文静，袁道强，高松洁.植物组织培养的应用现状[J].河南师范大学学报，2000（3）：137-139.