吕贵斌
为研究复方郁金散治疗鸡大肠杆菌病疗效情况,实验中对某疑似鸡大肠杆菌病的病例进行病原分离鉴定,确定其病原为致病性大肠杆菌。在此基础上,选用复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散进行中药药敏实验。从中发现,复方郁金散对大肠杆菌高敏感。且用复方郁金散对患有大肠杆菌病的鸡只进行治疗,取得较好效果。
一、材料
1.病料 疑似大肠杆菌病的鸡、小白鼠。
2.实验药物 中药方剂复方郁金散(郁金150克、黄柏90克、黄芩90克、栀子80克、白芍80克、茯苓80克、诃子60克、甘草60克、黄连30克),黄连解毒汤,五味消毒饮,公英散,白头翁汤。
3.仪器及培养基 ①仪器。超净工作台、冰箱、高压灭菌器、恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、天平、酒精灯。②培养基。普通琼脂培养基、麦康凯培养基、三糖铁培养基、伊红美兰培养基、五糖发酵管、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、尿素琼脂培养基。
二、方法
1.病料分离培养 无菌采集发病鸡粪便,划线接种于伊红美兰培养基上,37℃培养24小时,观察其生长情况。取伊红美兰琼脂上菌落的一部分进行革兰氏染色,油镜下检查菌体形态染色特点,对分离菌进行初步鉴定。
2.生化实验 取可疑菌落另一部分在三糖铁斜面表面划线,之后深部穿刺。①五糖发酵实验。取三糖铁培养基上的可疑菌落分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖,37℃培养,24~48小时后观察其生长情况,并记录结果。②吲哚实验。取三糖铁上可疑菌落接种至蛋白胨水培养基中,置37℃恒温培养48~72小时,取出,沿管壁缓慢加入吲哚试剂1毫升,观察结果。③甲基红实验。取三糖铁上可疑菌落接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中,置37℃恒温培养24~48小时,取出,滴加数滴甲基红试剂至培养液中,摇匀观察结果。④二乙酰实验。取三糖铁上可疑菌落接种至葡萄糖蛋白胨水培养基中,置37℃恒温培养48~72小时,取出,加入二乙酰试剂甲液0.6毫升,乙液0.2毫升,摇匀,静置15~20分钟观察结果。⑤枸橼酸盐实验。取三糖铁上可疑菌落接种至枸橼酸盐培养基斜面上,经37℃恒温培养24~48小时,观察结果。⑥尿素实验。取三糖铁上可疑菌落,接种尿素琼脂斜面,不穿刺到底部,下部留作对照。37℃恒温培养24~48小时,观察结果。
3.动物回归试验 取相同条件下小白鼠10只,分为2组,每组5只。第一组5只小白鼠腹腔注射大肠杆菌液1.5毫升,另一组5只小白鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水,作为对照组,正常情况下饲养,进行观察。
4.中药药敏实验 ①普通营养琼脂制备。将玻璃平皿洗净晾干。用干燥灭菌箱120℃灭菌1小时。将消毒好的琼脂趁热通过玻璃棒引入平皿,每皿需20~25毫升琼脂液,琼脂厚度3~4毫米,倒完盖上平皿,凉透放入冰箱备用。②药敏片制备。将滤纸片用打孔器或剪刀剪成小圆形或小正方形,用干燥灭菌箱灭菌备用。③接种病原大肠杆菌。死鸡内脏大肠杆菌含菌量很高,因此可以直接用接种环蘸取病死鸡内脏组织(肝、心包、气囊等),然后均匀涂布于琼脂表面,但注意不要划破琼脂,然后在平皿底壁中心及四周用钢笔写上药物名称(一般一个平皿做5种药物)。④中药药液制备。复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散,每种中药准确称取10克粉碎后,用纱布包好,放入1000毫升烧杯内,煎药时间按药性不同确定。根据煎药时间不同,加入200~400毫升自来水,浸泡1小时,然后用电炉分别煎30分钟,过滤。沉渣再加1∶8或1∶5自来水继续煎30分钟,过滤。将灭菌干燥好的药敏片浸入煎煮好的复方郁金散、白头翁散、黄连解毒汤、五味消毒饮、公英散药液中。浸入数分钟后,再用细针头蘸取药片贴到琼脂上(与所写药名的位置对应),最后放入恒温箱37℃培养,18~20小时观察结果。⑤药物敏感性判定。抑菌圈直径与药物敏感性关系如下:抑菌直径>20毫米为极敏感;抑菌直径在15~20毫米为高敏感;抑菌直径在10~14毫米为中敏感;抑菌直径<10毫米为低敏感;抑菌直径为0不敏感。
三、结果
1.涂片染色镜检 革兰氏染色镜检,见到革兰氏阴性、散在的小杆菌。
2.菌落形态及培养 伊红美兰琼脂上为许多圆形或椭圆形黑色略带金属光泽的菌落。
3.大肠杆菌的生化结果
4.动物回归实验结果 注射生理盐水的小白鼠精神状态良好,无发现任何发病症状。注射大肠杆菌液的小白鼠第一天死亡1只,第二天死亡2只,第三天死亡1只,1只耐过。取发病死亡的小白鼠的心脏、肝脏组织,进行革兰氏染色涂片镜检,镜下为单在或成对、散在的粉红色菌落。
5.中药药敏实验结果 从恒温培养箱取出琼脂平板,用带有刻度的尺子测量抑菌圈直径,复方郁金散抑菌圈直径为18毫米,对大肠杆菌高敏感;白头翁散抑菌圈直径为12毫米,对大肠杆菌中敏感;黄连解毒汤抑菌圈直径14毫米,对大肠杆菌中敏感;公英散抑菌圈直径8毫米,对大肠杆菌低敏感;五味消毒饮未见有抑菌圈出现,对大肠杆菌不敏感。
通过本次试验研究,对可疑大肠杆菌病鸡的病原菌进行分离培养鉴定,染色特性,培养特性,生化特性,动物回归实验与大肠杆菌标准特性基本一致。由此可确定为大肠杆菌。
四、临床治疗
用大剂量复方郁金散对患有大肠杆菌病的鸡只进行治疗,有效降低鸡只死亡率及发病率。城子坦某鸡场今年暴发两次大肠杆菌病,均用复方郁金散对鸡群进行治疗。第一批鸡场共1万只鸡,1000只鸡发病,用复方郁金散治疗,治愈980只,死亡20只。第二批共9000只鸡,发病500只,治愈470只,死亡30只。与其他药物相比,治愈率较高,死亡率很低。
五、结论
1.通过分离培养鉴定、涂片镜检、生化试验、动物回归试验,确为致病性大肠杆菌。
2.药敏实验结果显示复方郁金散对大肠杆菌高敏感。
3.临床治疗,用复方郁金散对鸡进行治疗,表明复方郁金散治疗效果较好。