胃镜活检组织RASSF1基因启动子甲基化检测及其临床意义分析＊

杨 军，关秀文，牛彦锋，杜寒松，翟荣林，曾 荣，张万里（.黄陂区人民医院外一科，武汉 4000；华中科技大学同济医学院附属协和医院：.胃肠外科；.肝胆外科；4.肿瘤中心，武汉 400）

胃癌的发病机制与表观遗传学密切相关，其中抑癌基因甲基化调控异常是其最重要的发病机制，相关的基因包括RAS相关结构域蛋白1（RASSF1）编码基因等［1－2］。RASSF1基因是在从3号染色体短臂克隆获得的一种新的抑癌基因，所编码的RASSF1蛋白通过RAS介导的信号通路发挥促进细胞凋亡的生物学效应。目前已证实RASSF1基因在胃癌组织中的表达水平显著低于正常组织，且表达水平与临床病理因素密切相关，可用于胃癌患者病情判断及预后评估［3－4］。本研究基于基因甲基化与蛋白质表达的关系，分析了胃癌患者胃镜活检组织RASSF1基因启动子甲基化水平，探讨RASSF1基因启动子甲基化在胃癌诊断及患者病情判断、预后评估中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年1月至2013年6月行胃镜检查的胃癌患者75例纳入患者组（GAC组），均经体格检查、影像学检查、胃镜活检标本和手术切除标本病理组织学检查确诊。75例患者中，男40例、女35例，年龄30～75岁，平均（51.2±12.6）岁。同期胃镜检查正常的健康者75例纳入对照组（CON组），男39例、女36例，年龄30～75岁，平均（50.7±12.3）岁。两组研究对象间性别构成和年龄分布比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 采集GAC组患者胃镜活检癌组织和癌旁组织标本，以及CON组健康者正常胃组织标本。参照基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取组织标本DNA，提取后的DNA经纯化后用于检测RASSF1基因启动子甲基化水平。采用甲基化检测试剂盒对DNA标本进行重亚硫酸盐转化，再对RASSF1基因启动子甲基化状态进行检测。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测RASSF1基因启动子甲基化状态。引物设计采用 Methprimer软件（http：／／www.urogene.org／cgi－bin／methprimer／methprimer.cgi），引物序列见表1。MSP扩增体系为25μL，循环条件为：95℃10min，95℃1 min、64℃45s、72℃30s循环25次，72℃10min。扩增后的产物经凝胶电泳后显影检测。

表1 RASSF1基因启动子MSP检测引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS12.0统计学软件进行数据处理与分析。计数资料采用百分率表示，组间比较采用卡方检验；显著性检验水准α＝0.05，P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RASSF1基因启动子甲基化比较 75例GAC组患者癌组织及癌旁组织标本中，47例癌组织标本检出RASSF1基因启动子甲基化，甲基化率为62.7%，3例癌旁组织标本检出RASSF1基因启动子甲基化，甲基化率为4.0%。75例CON组健康者正常组织标本中，2例检出RASSF1基因启动子甲基化，甲基化率为2.7%。GAC组患者癌组织标本RASSF1基因启动子甲基化率高于癌旁组织和CON组健康者正常组织，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），癌旁组织和正常组织RASSF1基因启动子甲基化率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 RASSF1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系 胃癌患者癌组织RASSF1基因启动子甲基化率在不同性别、年龄、病变部位及幽门螺杆菌（HP）感染患者之间的比较差异无统计学意义（P＞0.05），在不同分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和TNM分期患者间的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），分化程度高、无淋巴结转移、无远处转移和TNM分期早的胃癌患者RASSF1基因启动子甲基化率低于分化程度低、有淋巴结转移、有远处转移和TNM分期晚的患者，具体结果见表2。

表2 RASSF1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系

3 讨 论

RASSF1基因是从3号染色体短臂克隆获得的抑癌基因，所编码的RASSF1蛋白具有促进细胞凋亡的生物学效应，与肿瘤的发病机制密切相关。当RASSF1表达异常时，失去对细胞周期的调控，导致正常细胞发生无限制的增殖而出现癌变。已有研究发现，RASSF1蛋白在消化道肿瘤的诊断及患者病情判断、预后评估中具有分子标志物作用［4－6］。研究证实，胃癌组织RASSF1表达水平显著低于健康者正常组织，且其表达水平与胃癌临床病理因素紧密相关。杜鸿等［3］采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测了胃癌患者RASSF1基因mRNA表达，发现其在胃癌组织中的表达缺失率显著高于癌旁组织和正常胃黏膜组织，且其表达水平与胃癌TNM分期、浸润深度和淋巴结转移具有一定的相关性。叶梅等［7］检测了胃癌组织RASSF1基因mRNA和蛋白质表达水平，结果证实胃癌组织RASSF1A基因mRNA和蛋白表达水平明显低于癌旁正常组织，免疫组织化学检测结果显示RASSF1A在所有癌旁正常组织中的表达均为阳性，而在胃癌组织中的表达则明显减弱或缺失，同时也发现RASSF1AmRNA及蛋白表达水平与胃癌分期显著相关。上述研究报道均说明RASSF11基因表达缺失与胃癌的发病机制密切相关，同时说明其在胃癌诊断及患者病情判断、预后评估方面具有较大的临床价值，但目前对RASSF1基因表达缺失导致组织癌变的具体作用机制尚无相关研究。

表观遗传学是基因的核苷酸序列不发生改变时，非基因序列改变所导致的基因表达改变的生命现象，主要包括基因DNA甲基化和组蛋白乙酰化等调控机制。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶作用下，基因组5′CpG二核苷酸胞嘧啶共价结合1个甲基基团，形成甲基化CpG（mCpG）。mCpG与DNA甲基结合蛋白（MBP）结合或直接阻碍转录因子与DNA启动子序列结合，间接抑制基因表达［8－9］。DNA启动子甲基化除基因突变外最为主要的肿瘤发病机制，甲基化水平可准确反映肿瘤患者病情及预后，较传统的蛋白质水平生物标志物具有更高的灵敏度和特异度［10－12］。基于表观遗传学与基因表达的关系，以及胃癌组织中RASSF1基因表达下降的事实，可以认为RASSF1基因表观遗传学改变可能是导致其mRNA和蛋白表达异常的首要原因。本研究采用MSP技术对胃癌患者和健康者胃组织标本RASSF1基因启动子甲基化进行了检测，结果发现胃癌患者癌组织标本RASSF1基因启动子甲基化率为62.7%，癌旁组织为4.0%，健康者正常胃组织甲基化率为2.7%，癌组织RASSF1基因启动子甲基化率高于癌旁组织和正常胃组织（P＜0.05），证实胃癌RASSF1基因启动子甲基化与其表达水平的降低密切相关，RASSF1基因启动子甲基化导致其基因表达水平下降，从而导致RASSF1表达异常，失去对细胞周期的正常调控，导致正常胃细胞发生无限制增殖而癌变，最终出现胃癌表型。本研究同样间接证实可将逆转RASSF1基因启动子甲基化用于胃癌患者的临床治疗。

本研究比较了胃癌患者癌组织RASSF1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系，发现RASSF1基因启动子甲基化率在不同性别、年龄、病变部位及HP感染患者间的比较差异无统计学意义（P＞0.05），在不同分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和TNM分期患者间的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），肿瘤分化程度越低、最大径越大、有淋巴结转移、远处转移和肿瘤分期晚的患者，其RASSF1基因启动子甲基化率越高，表明RASSF1基因启动子甲基化与胃癌患者的病情和预后密切相关，与RASSF1基因mRNA和蛋白质表达在胃癌患者病情判断及预后评估中的作用一致，间接证实基因表达合乎基因法则，均可作为胃癌患者病情判断及预后评估的分子标志物。与手术切除标本对比，胃镜活检组织RASSF1基因启动子甲基化检测可在术前提供准确的病情判断和预后评估依据，具有更为广泛的临床应用价值。

胃癌的发病机制主要与基因表达异常有关。目前的研究发现，环境等因素作用于机体后可导致基因表达异常，其中基因突变是最早被发现的，也是最经典的胃癌发病机制［13－14］。然而，有研究发现，某些胃癌患者的基因并不存在明显的突变，但存在基因表达的异常，进一步的研究发现，不依赖于基因碱基序列改变的表观遗传学在胃癌的发病机制中扮演重要角色，先天性或后天性作用因素均可导致胃癌相关基因发生表观遗传学改变，包括基因启动子甲基化和乙酰化改变，最终导致相关基因不能正常结合转录因子，从而抑制基因表达，最终产生胃癌表型［15－16］。目前发现的与胃癌相关的基因包括TIMP3基因［17］、上皮型钙黏附素［18］、WRN 基因［19］和 BNIP3基因［20］等。随着研究的逐渐深入，相信越来越多的基因表观遗传学作用机制将被发现参与了胃癌的发生、发展及转归。目前的研究发现，与基因突变不同，基因启动子甲基化可被药物逆转从而使基因重新表达，因而具有潜在的临床治疗价值。5－氮杂－2′－脱氧胞苷是目前广泛报道的用于逆转基因启动子甲基化的药物［21］。体外试验表明，5－氮杂－2′－脱氧胞苷具有去甲基化作用，能逆转多种抑癌基因启动子甲基化状态，使其恢复表达，进而恢复抑癌功能，并在多种肿瘤细胞株中得到证实［22－23］。尽管体外试验证实5－氮杂－2′－脱氧胞苷具有抑制甲基转移酶，从而逆转基因启动子甲基化的作用，但目前尚无相关体内试验研究的证实，因此5－氮杂－2′－脱氧胞苷的临床应用尚存在给药困难及尚未得到体内试验研究证实等问题，极大地限制了其在临床中的广泛应用。然而，随着分子生物学技术的发展，逆转基因启动子甲基化在非基因突变所致肿瘤中的应用终将成为现实。

［1］陈姣艳.RASSF1A基因抑制人胃癌SGC－7901细胞生长及其与cyclin D1、p16基因相关性研究［D］.湖南：南华大学，2010.

［2］李辉，郭丽，冒晓蓓，等.胃癌患者血清RASSF11A基因启动子区甲基化检测及其临床意义［J］.中国实用医药，2009，4（20）：11－13.

［3］杜鸿，钟丰云，秦陈浩，等.RASSF1A在胃癌组织中的表达及临床意义［J］.山东医药，2010，50（40）：52－53.

［4］毕婧，高明阳，王衍富，等.Ras相关区域家族基因启动子甲基化改变与肿瘤发生相关性的研究进展［J／CD］.中华临床医师杂志：电子版，2012，6（16）：4835－4838.

［5］赵玲.胰腺癌中RASSF2A启动子甲基化状态的检测及其临床病理意义［D］.北京：北京协和医学院，2009.

［6］何玉，晋茂生，杜丹丽，等.RASSF1A基因在卵巢癌组织及腹腔冲洗液中甲基化的研究［J］.蚌埠医学院学报，2011，36（1）：35－37.

［7］叶梅，夏冰，郭秋莎，等.ras相关结构域家族1A基因在胃癌组织中表达的意义［J］.中华消化杂志，2007，27（3）：150－153.

［8］张仁礼，刘彩霞，孟锦绣，等.胚胎干细胞分化为表皮样细胞基因启动子区差异甲基化的研究［J］.中国病理生理杂志，2013，29（5）：769－777.

［9］宋东建，张毅，王磊，等.p73基因在肾母细胞瘤组织中的表达及甲基化相关性研究［J］.中华实用儿科临床杂志，2013，28（11）：823－827.

［10］王海英.宫颈病变程度与人乳头瘤病毒16型甲基化水平的关系研究［J］.中国计划生育学杂志，2013，21（4）：234－237.

［11］王晓天，宋永胜，崔军，等.膀胱移行细胞癌组织与尿沉渣细胞WWOX基因启动子甲基化相关性研究［J］.重庆医学，2013，42（14）：1564－1567.

［12］景坤玉，董腾慧，郭明洲，等.食管鳞状细胞癌细胞及组织中钙敏感受体基因启动子区甲基化状态检测［J］.郑州大学学报：医学版，2013，48（2）：155－159.

［13］燕速，白振忠，赵健信，等.CYP2E1DraⅠ基因遗传多态性与青海省胃癌人群易感性的相关性研究［J］.中国癌症杂志，2013，23（4）：273－278.

［14］马俊华，汪必成.胃癌中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白27基因蛋白表达、基因突变及其与启动子甲基化的关系［J］.中华实验外科杂志，2013，30（5）：1048－1050.

［15］李永丽，张立玮.单发胃癌和食管／胃双原发癌中胃癌CDH1基因甲基化研究［J］.中国全科医学，2012，15（9）：1006－1009.

［16］许丽霞，曾志荣，于君，等.肿瘤抑制基因启动子区甲基化在胃癌中的功能意义及临床价值［J］.中华消化杂志，2011，31（4）：286－288.

［17］李冬霞，邓晓慧，李巧香，等.胃癌患者TIMP3基因启动子区CpG岛甲基化状态及蛋白表达［J］.中国老年学杂志，2013，33（10）：2256－2258.

［18］李晓军，赵阳，任宏，等.遗传性和散发性胃癌上皮型钙黏附素的表达和启动子甲基化状态的关系［J］.南方医科大学学报，2013，33（1）：125－127.

［19］王琳，沈洁，孟丽娟，等.胃癌组织中硫酸酯酶2和 WRN基因启动子甲基化与伊立替康药物敏感性的关系［J］.中华肿瘤杂志，2013，35（6）：418－422.

［20］王银玲，王亿龙，王齐晖，等.腹腔冲洗液BNIP3基因甲基化与胃癌患者腹膜微转移及疾病的相关性研究［J］.中国医科大学学报，2012，41（10）：934－936.

［21］何苗，汤为学，姜蓉，等.DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5－氮杂－2′－脱氧胞苷对胃癌的影响［J］.中国病理生理杂志，2012，28（7）：1262－1268.

［22］袁昌劲，唐求，王辉，等.5－氮杂－2′－脱氧胞苷对胃癌 AGS细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨［J］.山东医药，2011，51（14）：3－5.

［23］孟春风，朱新江，戴冬秋，等.5－氮杂－2′－脱氧胞苷和曲古抑菌素A对胃癌细胞中P16和hMLH1及MGMT基因启动子甲基化和mRNA表达的影响［J］.中华胃肠外科杂志，2009，12（5）：494－497.