龙胆碱对高热惊厥大鼠海马神经细胞凋亡的影响

刘学伟，汪 娜，姚素媛，刘树民(通讯作者)

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

研究表明，反复或持续高热惊厥(Febrile Convulsions，FC)常导致儿童智力低下等继发性脑损伤[1］。课题组前期研究结果显示，中药龙胆经碱化处理后获得的活性成分龙胆碱具有一定的抗惊厥作用，且对惊厥性脑损伤具保护作用，其作用机制涉及多个方面[2－5］。而凋亡与惊厥性脑损伤关系密切，龙胆碱是否通过抑制凋亡而发挥其抗脑损伤作用少有报道，因此，本实验通过探讨龙胆碱对惊厥后海马神经元的凋亡的抑制作用，进而阐明龙胆碱的脑损伤保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器:龙胆碱(自制，经 mp、UV、IR、1H NMR、13C NMR、MS鉴定，纯度经HPLC峰面积归一化法检测，龙胆碱含量＞98.4%);原位细胞凋亡检测试剂盒(北京中杉金桥公司);研究用生物显微镜(Olympus Bx60日本);数码医学图像分析系统(MoticMed6.0福建)等。

1.2 实验动物与分组:21日龄Wistar大鼠100只，雌雄各半，体重50±20 g，[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为:SCXK(沪)，2003－003］。按照有关文献方法[2，6］。100只大鼠随机抽取15只作为对照组，其余85只进行筛选，首次惊厥，大鼠在水中5 min如不惊厥则取出弃去不用，5min内发生惊厥者则惊厥开始时即取出，共有61只鼠进入实验组。实验组再次随机分为FC组、GT1、GT2组。GT1、GT2组于每次惊厥后立即注射200mg/kg、50mg/kg(2013RFQXJ154)龙胆碱生理盐水溶液。FC组及空白对照组给予同体积生理盐水。隔日诱导惊厥1次，共10次。空白组置37℃水浴中5min，共10 次。

1.3 标本制备及检测:大鼠末次惊厥后24 h，以20%乌拉坦腹腔注射麻醉，剖胸暴露心脏，经左心室－升主动脉插管先用生理盐水再用4%多聚甲醛经左心室灌注，使脑标本固定石蜡包埋标本，冠状切片，切片厚度10μm，按照原位末端脱氧核苷酸生物素末端标记检测试剂盒提供方法及操作步骤进行。

1.4 结果判定和阳性细胞分析方法:TUNEL染色法观察神经细胞凋亡的表达，阳性细胞为细胞核着棕褐色。细胞凋亡切片图像结果分析方法:采用MoticMed6.0数码医学图像分析系统，每组选7张切片，利用显微摄像系统，每张切片在200倍下随机选取海马5个非重叠视野，按照512×512像素分布摄入图像并保存于病理图像分析系统内，选择凋亡分析模块，通过灰度调节，区分视野内凋亡细胞面积与平均灰度，进行统计分析。

1.5 统计学处理:应用SPSS 14.0软件进行统计分析，数值以)表示。各组间差异，用均值间两两比较，采用t检验。

2 实验结果

TUNEL染色后模型组海马区可见较多神经细胞核呈棕褐色阳性反应，凋亡细胞面积显著增加，平均灰度明显增强，与正常组比较P＜0.01。而龙胆碱高、低剂量组细胞核棕褐色的阳性细胞面积较模型组明显减少(P＜0.01)，平均灰度明显降低，与FC组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。龙胆碱高、低剂量组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。正常对照大鼠仅偶见TUNEL阳性染色细胞核。

表1 TUNEL法检测各组大鼠凋亡细胞面积与平均灰度

表1 TUNEL法检测各组大鼠凋亡细胞面积与平均灰度

注:#与空白组比较P＜0.01，*与FC组比较P＜0.05

组别 例数 凋亡细胞面积 平均灰度NG组7 110.161 ±55.289 120.487 ±4.315 FC 组 7 1 741.202 ±403.904# 130.249 ±4.189#GT1 组 7 474.431 ±166.166* 119.591 ±4.153*GT2 组 7 399.950 ±190.548* 121.642 ±8.646*

3 讨论

研究表明，惊厥发作可导致海马、杏仁核、大脑皮质、丘脑、小脑等多部位神经元丧失，而这种神经元丧失是通过坏死与凋亡两条途径实现的[7］。惊厥发生时会导致兴奋毒性神经元损伤的谷氨酸NMDA受体激活及细胞内钙超载均可启动凋亡发生[8］，故认为凋亡与惊厥性脑损伤关系密切。不仅如此，凋亡发生多少还可反映惊厥发作严重程度，反复多次或严重强直阵挛性抽搐可诱发大量细胞凋亡，因此推测凋亡不但是惊厥性脑损伤结果，更可能通过引起脑内抑制性神经元丢失，进一步增加脑组织兴奋性，从而导致更严重的惊厥性脑损伤，故凋亡减轻与否可能直接影响惊厥性脑损伤程度。

本实验结果表明，模型组中胞质中胶质细胞的凋亡较多，由于正常情况下胶质细胞对神经细胞提供营养、支持与保护作用，提示惊厥后海成区神经细胞失去营养供应与保护，超微结构发生紊乱，导致脑损伤的发生。通过TUNEL法观察，模型组可见较多神经细胞核呈棕褐色阳性反应，凋亡细胞面积显著增加，平均灰度明显增强。而龙胆碱高、低剂量组细胞核棕褐色的阳性细胞面积较模型组明显减少，平均灰度明显降低，提示应用药物后可以抑制细胞凋亡的发生，该作用可能是龙胆碱发挥脑损伤保护作用的机制之一。

[1]周戬平，郑娜，王帆，等.热性惊厥对大鼠行为运动及空间学习记忆的影响[J］.中华儿科杂志，2004，42(1):50.

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[3]姚素媛，刘学伟，刘树民，等龙胆碱对高热惊厥模型大鼠脑内氨基酸类神经递质含量及海马区GABAB、Glu受体的影响[J］.时珍国医国药，2009，18(12):2875 －2877.

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[6]杨志仙，秦炯，周国平，等.发育期大鼠高热惊厥脑损伤模型的建立[J］.北京大学学报(医学版)，2002，34(3):225.

[7]帅海平，王子才.101例高热惊厥患儿的转归[J］.实用儿科临床杂志，2003，18(9):724 －725.

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