CYP19A1基因多态性与多囊卵巢综合征的相关性研究

甄 鑫，颜桂军，孙海翔，乔 迪，王 勇

0 引 言

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是最常见的育龄妇女内分泌疾病，全球范围内的发病率在5%～10%［1］。卵巢功能障碍是PCOS患者的核心病理生理问题，可导致窦卵泡发育停滞，无法进一步转化为成熟卵泡，而卵巢多囊样改变、持续无排卵和高雄激素血症是疾病的基本临床特征［2－3］。目前研究显示，PCOS是一种涉及多器官、多系统的复杂性疾病，与2型糖尿病、高血压、高血脂以及子宫内膜癌等疾病的发生有关，对患者的健康有长期影响［2，4－5］。

越来越多的证据显示PCOS发病具有显著地家族聚集性。遗传因素在PCOS发生发展中扮演了重要的角色，而雄激素的过量产生是PCOS的核心病理生理特征之一［6］。因此，雄激素代谢路径上的多种酶的编码基因如 HSD17B6、CYP19、CYP17等均曾被检验基因多态性，并发现数个阳性的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点［7－8］。其中 CYP19 基因编码产物芳香化酶在雄激素代谢中发挥重要作用，因此该基因上的SNP在高雄激素血症的发生发展中扮演了重要角色。

本研究采用病例-对照研究的方法探索SNP对PCOS易感性的影响，并将不同基因型的血清激素水平进行比较，探索SNP与PCOS发病及性激素相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究共纳入2007年1月至2012年12月就诊于南京大学医学院附属鼓楼医院的373名PCOS患者作为PCOS组，以同期313名正常对照者作为对照组，均为中国汉族女性。PCOS的诊断采用2003年的鹿特丹标准(The Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group，2004)［9］，当满足以下 2 条以上时，即可诊断PCOS:①临床或者生化检查确诊的高雄激素血症，②月经稀少或者无月经，③超声检查发现卵巢多囊表现;排除标准:高泌乳素血症，库欣综合征等其他引起高雄激素血症的疾病。对照组入选标准为:①月经周期正常，②基础生殖激素水平检测结果正常;排除标准:①肥胖、多毛、皮脂过多等高雄激素表现;②糖尿病家族史;③胰岛素抵抗。

本研究获得南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或亲属均签订了知情同意书。

1.2 数据收集 本研究收集了所有受试者的初潮年龄(age at menarche，AAM)、身高、体重等数据，计算了体重指数(body mass index，BMI)。所有受试者采血前3个月内均未接受任何激素治疗，如口服避孕药等。对于仍有月经的受试者，外周血标本在月经周期的第3～5天获取，而对已经绝经的患者则在任意时间获取。所有的外周血标本均在12 h禁食后的早晨8:00－9:00点抽取。血标本取得后均立即离心并将血清储存在－80℃冰箱中，血清中各种性激素的测量采用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)，包括黄体生成素(luteotropichormone，LH)、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、雌激素、睾酮。雌激素/睾酮值被用来评估芳香化酶的活性。

1.3 实验方法 所有受试者的DNA提取自外周血标本，应用 Chelex®-100(Promega，Madison，WI，USA)作为介质从白细胞中提取。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)对CYP19基因rs2899470多态性位点进行分型。上游引物序列5'-CAGGTAGCTCTGTGGAATAGCC-3'，下游引物序列为5'-GCAGAAAATTAATGAGGACCACAG-3'。

1.4 统计学分析 采用SAS 9.1.3软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验和精确概率法。计量资料用均数±标准差()表示，多组均数比较采用单因素方差分析，2组均数比较用t检验。血清激素水平的比较采用协方差分析，以年龄和BMI为协变量，以P≤0.05为差异有统计学意义。同时PCOS和对照组基因型分布是否符合Hardy-Weinberg分布也进行了χ2检验，P＞0.05被认为符合Hardy-Weinberg分布。

2 结 果

对照组与PCOS组在年龄、BMI、激素水平差异有统计学意义(P＜0.01)，在AAM方面差异无统计学意义(P＞0.01)。见表1。经检测，rs2899470位点符合Hardy-Weinburg平衡(P=0.96)。所有686名研究对象等位基因型分布为GG 289(42.1%)、TG 337(49.1%)、TT 60(8.7%)，PCOS 组和对照组之间等位基因型和等位基因频率分布差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

PCOS组雌激素/睾酮值与rs2899470基因型有关，PCOS组患者间GG、TG、TT等位基因差异有统计学意义(P＜0.01)。无论在 PCOS组还是对照者，除雌激素/睾酮值外的其他激素水平以及年龄、BMI等基本参数在不同等位基因型之间差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表3。

表1 PCOS组和对照组基本情况以及激素水平比较()Table 1 Demograhic characteristics and hormone levels of the PCOS patients and healthy controls()

表1 PCOS组和对照组基本情况以及激素水平比较()Table 1 Demograhic characteristics and hormone levels of the PCOS patients and healthy controls()

组别 n 年龄(岁) BMI(kg/m2) FSH(IU/L) LH(IU/L) LH/FSH 雌激素(pg/mL) 睾酮(ng/mL) AAM(岁)对照组 313 32.14 ±4.66 21.29 ±3.23 8.04 ±3.00 4.96 ±2.76 0.67 ±0.42 43.38 ±19.52 1.19 ±0.97 14.88 ±1.83 PCOS 组 373 26.86 ±5.10 22.81 ±4.07 6.53 ±4.77 13.0 ±9.68 2.23 ±1.65 50.76 ±25.80 2.72 ±2.35 14.23 ±2.06 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001 0.0020.204

表2 PCOS组和对照组CYP19基因rs2899470多态性位点等位基因频率及各基因型频率分布［n(%)］Table 2 Frequency of allelic genes and distribution of genotypes of rs2899470 in the PCOS patients and healthy controls n(%)

表3 Rs2899470位点基因型与基本参数以及性激素水平相关性Table 3 Association of genotypes of rs2899470 and hormone levels in the PCOS patients and healthy controls

3 讨 论

SNP是人类可遗传变异中最常见的一种，具有数量多、分布广、密度大、突变率低等特点，对疾病在基因中定位的研究有重要的作用，至今仍是寻找PCOS发病相关基因的主要手段。本研究结果提示，PCOS组和对照组在 CYP19基因上的 SNP位点rs2899470等位基因频率分布上存在差异。

CYP19A1基因位于染色体15q21.2区位，包括30 kb的编码区和93kb的调控区，其编码产物芳香化酶在性腺内、外组织中都是雌激素合成的关键酶。SNP rs2899470位于该基因的10号内含子，与血清多种类固醇激素如睾酮、雌激素等的水平息息相关［10－11］。Eriksson等［12］的研究显示，位于 CYP19A1上的 SNP rs2470152对高加索妇女血清雌酮水平具备良好的预测性，而rs2899470与血清雌激素水平的相关性则稍弱。本研究结果显示，在 PCOS患者中，虽然rs2899470的不同基因型与雌激素水平并无显著联系，但GG基因型受试者的雌激素/睾酮值明显要低于TT基因型受试者，提示芳香化酶活性的降低。这一结果与Jiang等［13］在男性骨质疏松骨折患者中的发现不同，该研究发现基因型为GG的受试者雌激素/睾酮水平要明显高于其他基因型的受试者，可能与不同的患者群体选取有关。

雌激素/睾酮是芳香化酶活性的重要指标，因为雄激素转变为雌激素需要芳香化酶的活性，而CYP19A1正是芳香化酶的编码基因［14］。因此，rs2899470上等位基因G可能与芳香化酶活性降低有关，进而影响了雄激素向雌激素的转化过程。芳香化酶活性的降低可直接造成卵巢性的高雄激素血症和PCOS的发生发展。多项过去的研究显示，芳香化酶相关基因的突变一旦影响其正常活性，PCOS的发生率会大大升高。1993年，Ito等［15］在1名18岁的女性性幼稚症患者中发现了芳香化酶缺陷与CYP19基因突变之间的联系，并在这名患者身上观察到了多囊卵巢以及高雄激素血症等PCOS患者的表现。Belgorosky等［16］发现，CYP19基因上的突变与芳香化酶缺陷的发生有关，在女孩中可直接影响FSH和LH的正常负反馈(正常情况下雌激素水平的下降会导致FSH和LH水平的升高)，导致血清中FSH和LH的浓度降低和卵巢囊肿的发生。Takayama等［17］的研究则发现，PCOS患者的窦卵泡组织完全没有芳香化酶的活性，提示PCOS发病与芳香化酶活性之间的密切关系。因此，本研究报道的rs2899470上的GG基因型可能通过降低芳香化酶活性增加了PCOS的发生风险，表现为雌激素/睾酮值的显著降低。

总之，本研究SNP的等位基因G可能是PCOS发生发展的相关基因之一，其机制可能与芳香化酶活性降低有关。

［1］Singh B，Panda S，Nanda R，et al.Effect of Metformin on Hormonal and Biochemical Profile in PCOS Before and After Therapy［J］.Indian J Clin Biochem，2010，25(4):367-370.

［2］Bates GW，Jr，Propst AM.Polycystic ovarian syndrome management options［J］.Obstet Gynecol Clin North Am，2012，39(4):495-506.

［3］李 慧，马向华，沈 捷.育龄期肥胖多囊卵巢综合征患者特异性临床代谢特征分析［J］.医学研究生学报，2011，24(7):707-712.

［4］Dumesic DA，Abbott DH，Padmanabhan V.Polycystic ovary syndrome and its developmental origins［J］.Rev Endocr Metab Disord，2007，8(2):127-141.

［5］卢 姗，马向华，沈 捷.单药或联合用药对多囊卵巢综合征促排卵效果的对照研究［J］.医学研究生学报，2011，24(3):263-267.

［6］Diamanti-Kandarakis E，Piperi C.Genetics of polycystic ovary syndrome:searching for the way out of the labyrinth［J］.Hum Reprod Update，2005，11(6):631-643.

［7］Jones MR，Italiano L，Wilson SG，et al.Polymorphism in HSD17B6 is associated with key features of polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2006，86(5):1438-1446.

［8］Gaasenbeek M，Powell BL，Sovio U，et al.Large-scale analysis of the relationship between CYP11A promoter variation，polycystic ovarian syndrome，and serum testosterone［J］.J Clin Endo-crinol Metab，2004，89(5):2408-2413.

［9］Rotterdam EA-SPCWG.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2004，81(1):19-25.

［10］Barrett JC，Fry B，Maller J，et al.Haploview:analysis and visualization of LD and haplotype maps［J］.Bioinformatics，2005，21(2):263-265.

［11］Bulun SE，Sebastian S，Takayama K，et al.The human CYP19(aromatase P450)gene:update on physiologic roles and genomic organization of promoters［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2003，86(3-5):219-224.

［12］Eriksson AL，Lorentzon M，Vandenput L，et al.Genetic variations in sex steroid-related genes as predictors of serum estrogen levels in men［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94(3):1033-1041.

［13］Jiang J，Tang NL，Ohlsson C，et al.Association of genetic variations in aromatase gene with serum estrogen and estrogen/testosterone ratio in Chinese elderly men［J］.Clin Chim Acta，2010，411(1-2):53-58.

［14］Jin JL，Sun J，Ge HJ，et al.Association between CYP19 gene SNP rs2414096 polymorphism and polycystic ovary syndrome in Chinese women［J］.BMC Med Genet，2009，10:139.

［15］Ito Y，Fisher CR，Conte FA，et al.Molecular basis of aromatase deficiency in an adult female with sexual infantilism and polycystic ovaries［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(24):11673-11677.

［16］Belgorosky A，Pepe C，Marino R，et al.Hypothalamic-pituitaryovarian axis during infancy，early and late prepuberty in an aromatase-deficient girl who is a compound heterocygote for two new point mutations of the CYP19 gene［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(11):5127-5131.

［17］Takayama K，Fukaya T，Sasano H，et al.Immunohistochemical study of steroidogenesis and cell proliferation in polycystic ovarian syndrome［J］.Hum Reprod，1996，11(7):1387-1392.