分光光度法测定水中叶绿素a的方法研究

刘畅

摘要按照《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》的规定，确立分光光度法测定水中叶绿素a的特性指标，为本方法国家标准的制定提供依据。结果表明：方法的检出限为0.094 mg/m3，精密度为5.87%~9.84%，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%。同时提出试验过程中的注意事项和关键点。

关键词分光光度法；叶绿素a；测定方法；特性指标；注意事项

中图分类号O657.31文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

叶绿素a是评价湖泊富营养化的重要参数[1]，我国尚无国家标准分析方法，目前叶绿素a监测的主要依据是《水和废水监测分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，该方法是B类方法，经过国内的研究和多个单位的实验验证表明是成熟的统一方法，有待上升为国家标准分析方法，但该方法未明确检出限、精密度和准确度等一系列方法特性指标，本文以《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》[3]为依据，通过试验确立本方法的特性指标，并结合日常工作经验提出本方法试验过程中的注意事项和关键点，为国标方法的建立以及分析人员的日常检测工作提供参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：紫外-可见分光光度计、离心机、抽滤装置、研钵、0.45 μm乙酸纤维滤膜。试剂：叶绿素a标准品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸镁粉末。

1.2试验方法

1.2.1过滤。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50 kPa）。水样抽完后，继续抽1～2 min，以减少滤膜上的水分，该过程需在避光条件下完成[4-5]。

1.2.2提取。将滤膜放入研钵中，加入少量碳酸镁粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（3 000~4 000 r/min）离心10 min（可根据样品的浓度和浊度适当延长离心时间），将上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，继续研磨提取，离心10 min，并将上清液再转入容量瓶中，重复1~2次，用90%丙酮定容为10 mL，摇匀。

1.2.3测定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分别读取750、663、645、630 nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

2结果与分析

2.1检出限

按照HJ168-2010[3]的规定，对叶绿素a浓度为0.5 mg/L的标准品进行测定，计算7次平行测定的标准偏差，按照下式计算方法检出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL为检出限；n为样品的平行测定次数；t为自由度为n-1且置信度为99%时的t分布（单侧）（n=7时，t=3.143）；S为n次平行测定的标准偏差。

结果表明，7次测定结果分别为0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，标准偏差（S）为0.030，检出限为0.094 mg/L。因此，叶绿素a的检出限为0.094 mg/L，当提取液定容体积为10 mL，水样量为1 000 mL时，叶绿素a 的检出限为0.94 mg/m3。

2.2准确度

由于目前没有叶绿素a的标准样品，因此以加标回收率考察方法的准确性[6]。本试验分别以空白加标和实际样品加标对方法的准确度进行考察，加标方法为对实际样品抽滤后，在研磨滤膜时加入叶绿素a标液，按照样品分析的全过程进行分析，空白加标以纯水代替实际样品，其余操作过程与实际样品相同，测定结果见表1。结果表明：空白样品的加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品的加标回收率为80.2%~87.0%，该方法的加标回收率较低，主要是因为研磨过程中叶绿素a的损失较大，如何减少损失、提高样品分析的准确性将有待进一步研究。

2.3精密度

对不同浓度的实际样品平行测定6次，计算相对标准偏差，考察方法的精密度，测定结果见表2。从测定结果可以看出，该方法的相对标准偏差分别为5.87%~9.84%。

3结论与讨论

试验结果表明，本方法的检出限为0.094 mg/m3，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%，精密度为5.87%~9.84%。据此提出试验过程中的注意事项和关键点：一是样品过滤前需充分摇匀，以免产生误差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤；三是如波长750 nm处的吸光度大于0.005，应将溶液再次（或多次）充分离心后测定吸光度，需要多次离心时，不可用原离心管继续离心，需将溶液转移至清洁干燥离心管中；四是因为叶绿素提取液对光敏感，故整个试验过程要尽量在微弱的光照下进行。

4参考文献

[1] 屠清英.湖泊富营养化调查规范[M].2版.北京：中国环境科学出版社，1990：268-270.

[2] 国家环境保护总局.水和废水监侧分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002：670.

[3] HJ 168-2010环境监测分析方法标准制修订技术导则[S].北京：中国环境科学出版社，2010.

[4] 高岐，赵旭光，谭煜媚.分光光度法测定-超声波提取植物韭菜中叶绿素含量的研究[J].食品工业科技，2007（8）：166-167.

[5] 汤灿辉，黄洁，肖美凤，等.浅谈用分光光度法测定虫茶中叶绿素的含量[J].求医问药，2012，10（11）：873-874.

[6] 周静，胡忠军，李培培，等.基于叶绿素a测定的分光光度法与bbe法比较：以千岛湖为例[J].水生态学杂志，2013，34（2）：80-84.

摘要按照《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》的规定，确立分光光度法测定水中叶绿素a的特性指标，为本方法国家标准的制定提供依据。结果表明：方法的检出限为0.094 mg/m3，精密度为5.87%~9.84%，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%。同时提出试验过程中的注意事项和关键点。

关键词分光光度法；叶绿素a；测定方法；特性指标；注意事项

中图分类号O657.31文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

叶绿素a是评价湖泊富营养化的重要参数[1]，我国尚无国家标准分析方法，目前叶绿素a监测的主要依据是《水和废水监测分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，该方法是B类方法，经过国内的研究和多个单位的实验验证表明是成熟的统一方法，有待上升为国家标准分析方法，但该方法未明确检出限、精密度和准确度等一系列方法特性指标，本文以《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》[3]为依据，通过试验确立本方法的特性指标，并结合日常工作经验提出本方法试验过程中的注意事项和关键点，为国标方法的建立以及分析人员的日常检测工作提供参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：紫外-可见分光光度计、离心机、抽滤装置、研钵、0.45 μm乙酸纤维滤膜。试剂：叶绿素a标准品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸镁粉末。

1.2试验方法

1.2.1过滤。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50 kPa）。水样抽完后，继续抽1～2 min，以减少滤膜上的水分，该过程需在避光条件下完成[4-5]。

1.2.2提取。将滤膜放入研钵中，加入少量碳酸镁粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（3 000~4 000 r/min）离心10 min（可根据样品的浓度和浊度适当延长离心时间），将上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，继续研磨提取，离心10 min，并将上清液再转入容量瓶中，重复1~2次，用90%丙酮定容为10 mL，摇匀。

1.2.3测定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分别读取750、663、645、630 nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

2结果与分析

2.1检出限

按照HJ168-2010[3]的规定，对叶绿素a浓度为0.5 mg/L的标准品进行测定，计算7次平行测定的标准偏差，按照下式计算方法检出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL为检出限；n为样品的平行测定次数；t为自由度为n-1且置信度为99%时的t分布（单侧）（n=7时，t=3.143）；S为n次平行测定的标准偏差。

结果表明，7次测定结果分别为0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，标准偏差（S）为0.030，检出限为0.094 mg/L。因此，叶绿素a的检出限为0.094 mg/L，当提取液定容体积为10 mL，水样量为1 000 mL时，叶绿素a 的检出限为0.94 mg/m3。

2.2准确度

由于目前没有叶绿素a的标准样品，因此以加标回收率考察方法的准确性[6]。本试验分别以空白加标和实际样品加标对方法的准确度进行考察，加标方法为对实际样品抽滤后，在研磨滤膜时加入叶绿素a标液，按照样品分析的全过程进行分析，空白加标以纯水代替实际样品，其余操作过程与实际样品相同，测定结果见表1。结果表明：空白样品的加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品的加标回收率为80.2%~87.0%，该方法的加标回收率较低，主要是因为研磨过程中叶绿素a的损失较大，如何减少损失、提高样品分析的准确性将有待进一步研究。

2.3精密度

对不同浓度的实际样品平行测定6次，计算相对标准偏差，考察方法的精密度，测定结果见表2。从测定结果可以看出，该方法的相对标准偏差分别为5.87%~9.84%。

3结论与讨论

试验结果表明，本方法的检出限为0.094 mg/m3，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%，精密度为5.87%~9.84%。据此提出试验过程中的注意事项和关键点：一是样品过滤前需充分摇匀，以免产生误差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤；三是如波长750 nm处的吸光度大于0.005，应将溶液再次（或多次）充分离心后测定吸光度，需要多次离心时，不可用原离心管继续离心，需将溶液转移至清洁干燥离心管中；四是因为叶绿素提取液对光敏感，故整个试验过程要尽量在微弱的光照下进行。

4参考文献

[1] 屠清英.湖泊富营养化调查规范[M].2版.北京：中国环境科学出版社，1990：268-270.

[2] 国家环境保护总局.水和废水监侧分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002：670.

[3] HJ 168-2010环境监测分析方法标准制修订技术导则[S].北京：中国环境科学出版社，2010.

[4] 高岐，赵旭光，谭煜媚.分光光度法测定-超声波提取植物韭菜中叶绿素含量的研究[J].食品工业科技，2007（8）：166-167.

[5] 汤灿辉，黄洁，肖美凤，等.浅谈用分光光度法测定虫茶中叶绿素的含量[J].求医问药，2012，10（11）：873-874.

[6] 周静，胡忠军，李培培，等.基于叶绿素a测定的分光光度法与bbe法比较：以千岛湖为例[J].水生态学杂志，2013，34（2）：80-84.

摘要按照《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》的规定，确立分光光度法测定水中叶绿素a的特性指标，为本方法国家标准的制定提供依据。结果表明：方法的检出限为0.094 mg/m3，精密度为5.87%~9.84%，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%。同时提出试验过程中的注意事项和关键点。

关键词分光光度法；叶绿素a；测定方法；特性指标；注意事项

中图分类号O657.31文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0238-01

ResearchonDeterminationofChlorophyllainWaterbySpectrophotometricMethod

LIU Chang

（Liaoning Environment Monitoring Center，Shenyang Liaoning 110161）

AbstractAccording to the Technical Guidelines for Development and Revision of National Environmental Monitoring Methods and Standards（HJ168-2010），characteristic factors of Chlorophyll a determinated by Spectrophotometric method was established which providing basis for the establishment of the national standard. The results were as follows：The detection limit and relative standard deviation were 0.094 mg/m3 and 5.87%~9.84%，respectively，and the blank standard addition recovery and the sample standard addition recovery were 83.8%~92.0% and 80.2%~87.0%，respectively.The points for attention and the key points were provided.

Key wordsspectrophotometric method；Chlorophyll a；detection method；characteristic factors；points for attention

叶绿素a是评价湖泊富营养化的重要参数[1]，我国尚无国家标准分析方法，目前叶绿素a监测的主要依据是《水和废水监测分析方法（第四版）》[2]中的分光光度法，该方法是B类方法，经过国内的研究和多个单位的实验验证表明是成熟的统一方法，有待上升为国家标准分析方法，但该方法未明确检出限、精密度和准确度等一系列方法特性指标，本文以《国家环境污染物监测方法标准制修订技术导则（HJ168-2010）》[3]为依据，通过试验确立本方法的特性指标，并结合日常工作经验提出本方法试验过程中的注意事项和关键点，为国标方法的建立以及分析人员的日常检测工作提供参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：紫外-可见分光光度计、离心机、抽滤装置、研钵、0.45 μm乙酸纤维滤膜。试剂：叶绿素a标准品（CAS NO：479-61-8）、90%丙酮溶液、碳酸镁粉末。

1.2试验方法

1.2.1过滤。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50 kPa）。水样抽完后，继续抽1～2 min，以减少滤膜上的水分，该过程需在避光条件下完成[4-5]。

1.2.2提取。将滤膜放入研钵中，加入少量碳酸镁粉末及2~3 mL 90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机（3 000~4 000 r/min）离心10 min（可根据样品的浓度和浊度适当延长离心时间），将上清液倒入10 mL容量瓶中，再加2~3 mL 90%丙酮，继续研磨提取，离心10 min，并将上清液再转入容量瓶中，重复1~2次，用90%丙酮定容为10 mL，摇匀。

1.2.3测定。取上清液于1 cm光程的比色皿，分别读取750、663、645、630 nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

2结果与分析

2.1检出限

按照HJ168-2010[3]的规定，对叶绿素a浓度为0.5 mg/L的标准品进行测定，计算7次平行测定的标准偏差，按照下式计算方法检出限：

MDL=t（n-1，0.99）×S

式中：MDL为检出限；n为样品的平行测定次数；t为自由度为n-1且置信度为99%时的t分布（单侧）（n=7时，t=3.143）；S为n次平行测定的标准偏差。

结果表明，7次测定结果分别为0.455、0.408、0.437、0.361、0.417、0.434、0.424 mg/L，标准偏差（S）为0.030，检出限为0.094 mg/L。因此，叶绿素a的检出限为0.094 mg/L，当提取液定容体积为10 mL，水样量为1 000 mL时，叶绿素a 的检出限为0.94 mg/m3。

2.2准确度

由于目前没有叶绿素a的标准样品，因此以加标回收率考察方法的准确性[6]。本试验分别以空白加标和实际样品加标对方法的准确度进行考察，加标方法为对实际样品抽滤后，在研磨滤膜时加入叶绿素a标液，按照样品分析的全过程进行分析，空白加标以纯水代替实际样品，其余操作过程与实际样品相同，测定结果见表1。结果表明：空白样品的加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品的加标回收率为80.2%~87.0%，该方法的加标回收率较低，主要是因为研磨过程中叶绿素a的损失较大，如何减少损失、提高样品分析的准确性将有待进一步研究。

2.3精密度

对不同浓度的实际样品平行测定6次，计算相对标准偏差，考察方法的精密度，测定结果见表2。从测定结果可以看出，该方法的相对标准偏差分别为5.87%~9.84%。

3结论与讨论

试验结果表明，本方法的检出限为0.094 mg/m3，空白加标回收率为83.8%~92.0%，实际样品加标回收率为80.2%~87.0%，精密度为5.87%~9.84%。据此提出试验过程中的注意事项和关键点：一是样品过滤前需充分摇匀，以免产生误差；二是使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤；三是如波长750 nm处的吸光度大于0.005，应将溶液再次（或多次）充分离心后测定吸光度，需要多次离心时，不可用原离心管继续离心，需将溶液转移至清洁干燥离心管中；四是因为叶绿素提取液对光敏感，故整个试验过程要尽量在微弱的光照下进行。

4参考文献

[1] 屠清英.湖泊富营养化调查规范[M].2版.北京：中国环境科学出版社，1990：268-270.

[2] 国家环境保护总局.水和废水监侧分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002：670.

[3] HJ 168-2010环境监测分析方法标准制修订技术导则[S].北京：中国环境科学出版社，2010.

[4] 高岐，赵旭光，谭煜媚.分光光度法测定-超声波提取植物韭菜中叶绿素含量的研究[J].食品工业科技，2007（8）：166-167.

[5] 汤灿辉，黄洁，肖美凤，等.浅谈用分光光度法测定虫茶中叶绿素的含量[J].求医问药，2012，10（11）：873-874.

[6] 周静，胡忠军，李培培，等.基于叶绿素a测定的分光光度法与bbe法比较：以千岛湖为例[J].水生态学杂志，2013，34（2）：80-84.